【硬核笔记】如何进行GC分离条件的优化？定性、定量？

　　气相色谱是有机实验室主要的设备之一，由于样品组分在气相中传质速度快，与固定相相互作用次数多，加上可供选择的固定液种类很多，可供使用的检测器灵敏度高、选择性好，因此气相色谱被广泛地应用在有机样品检测领域。但是，许多使用者对其是如何进行分离、定性、定量的，还不是很清楚，所以，操作起来畏手畏脚，不能得心应手。今天咱们就和王素丽教授一起学习一下，气相色谱是如何有效地进行分离条件优化？定性、定量？

　　色谱操作条件的选择和优化

　　1.固定相的选择

　　固定相类型：

　　气－固色谱：固体吸附剂

　　气－液色谱：固定液与载体

　　混合物在不同固定相上的分离，如图所示：

　　注：1－乙腈(强极性)；2－2-丙醇(质子受体)；3－1,2－二氯乙烷（弱极性）；4－三乙胺（质子受体）；5－正辛烷。

　　固定相种类的不同，直接影响到样品中各组分分离效果优劣。

　　固定相的选择一般按照“相似相溶原理”。

　　常用固定液：

　　固定相液的选择：

　　分离非极性物质，一般选用非极性固定液。

　　分离极性物质，一般按极性强弱来选择相应极性的固定液。

　　分离非极性和极性混合物时，一般选用极性固定液。

　　能形成氢键的试样，一般选用氢键型固定液。

　　对于复杂组分，一般可选用两种或两种以上的固定液配合使用。

　　2.载气种类的选择

　　载气种类的选择应考虑三个方面：载气对柱效的影响、检测器要求及载气性质。

　　(1) 载气摩尔质量大，可抑制试样的纵向扩散，提高柱效。

　　(2) 载气流速较大时，传质阻力项起主要作用，采用较小摩尔质量的载气(如H2、He)，可减小传质阻力，提高柱效。

　　(3) 在载气选择时，还应综合考虑载气的安全性、经济性及来源是否广泛等因素。

　　载气的选择与检测器有关：

　　TCD一般选用氢气或氦气做载气

　　FID 一般选氮气和氩气做载气

　　ECD 一般选氮气做载气

　　FPD 一般选氮气做载气

　　3. 载气流速的选择

　　根据公式，绘制H~u曲线，以实现最佳载气流速的获取，实际载气流速的选择。

　　在曲线的最低点，塔板高度H最小（Hmin），此时柱效最高。与H最小所对应的流速为最佳流速uopt

　　4. 柱长和内径的选择

　　柱长增加，分离度增大，对分离有利。但柱长增加也使传质阻力增大，色谱峰区扩展加剧，分析时间延长。因此，在确保一定分辨率的条件下应尽可能使用短色谱柱。

　　填充柱：柱长1~5 m，柱内径2~6 mm。

　　毛细管柱：柱长20~200 m，柱内径0.1~0.5 mm。

　　5. 柱温的选择

　　柱温对分离度的影响比较复杂。兼顾分离度和分析速度两个方面。

　　（1）柱温升高，被测组分的挥发度↑，即被测组分在气相中的浓度↑，tR↓，改善气相和液相的传质速率，有利于提高柱效，但低沸点组份峰易产生重叠。

　　（2）柱温降低，分离度↑，分析时间↑。对于难分离物质对，降低柱温虽然可在一定程度内使分离得到改善，但是不可能使之完全分离。这是由于两组分的相对保留值增大的同时，两组分的峰宽也在增加，当后者的增加速度大于前者时，两峰的交叠更为严重。

　　（3） 柱温选择：接近或略低于组分平均沸点时的温度。

　　沸点

　　柱温

　　固定液用量

　　气体

　　室温~100℃

　　20-30:100 红色担体

　　100~200℃

　　150℃

　　10-20:100 红色担体

　　200~300℃

　　150~200℃

　　5-10:100 白色担体

　　300~400℃

　　200~250℃

　　1-5:100 白色或玻璃担体

　　⑷ 组分复杂：宽沸程的试样，采用程序升温。

　　采用程序升温的方法能兼顾高、低沸点组分的分离效果和分析时间，使不同沸点组分基本上都在其较合适的平均柱温下进行分离。

　　程序升温条件：升温方式；起始温度；升温速度；终止温度。

　　6. 进样条件和进样量的选择

　　进样速度越快越好，这样可使样品汽化后能立即被载气带入色谱柱中。若进样时间过长，试样原始宽度变大，流出峰宽也必然变宽甚至发生峰变形。液体试样量一般进样0.1~5 uL，气体试样0.1~5 mL。进样量大，会使几个峰重叠在一起分离不好；但进样量太少，又会使含量少的组分因检测器灵敏度不够而检不出。最大允许的进样量,应控制在峰面积或峰高与进样量呈线性关系的范围内。

　　7. 气化室和检测器温度的选择

　　气化室温度的选择：

　　（1）原则是保证样品，同时不分解

　　（2）一般比样品组分最高沸点高30-50度或比柱温高30-70度。

　　检测器温度的选择：一般比柱温高30-50度。TCD要求温度恒定，FID要求温度>120度。

　　气相色谱定性分析方法

　　因为色谱定性分析主要依据每种组分的保留值，一般需要标准样品。如果没有已知纯物质，单靠色谱法本身对每一种分离后的组分进行定性鉴定是比较困难的，这是气相色谱分析的不足之处。

　　近年来，气相色谱与质谱、光谱等联用，既充分利用了色谱柱的高效分离能力，又利用了质谱、光谱的高鉴别能力，再加上计算机对数据的快速处理及检索能力，为未知物的定性分析开辟了广阔前景。

　　1. 利用已知物质对照定性分析

　　利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。

　　利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化，适用于样品中组分色谱峰过密。峰高增加即可能为加入的已知物，另一种情况：增加了一个色谱峰。

　　2. 用经验规律和文献值进行定性分析

　　当没有待测组分的纯标准样时，可用文献值定性或用气相色谱中的经验规律定性。

　　⑴ 碳数规律

　　一定温度下，同系物的调整保留值的变化遵循如下规律lgVr = An+B

　　⑵ 沸点规律（同族具有相同碳原子数目的同分异构体的对数调整保留值与沸点的关系lgVr = CTb + D）

　　⑶ 根据相对保留值定性

　　a.组分和基准物质的调整保留值的比值（一般选苯、正丁烷、环己烷作为基准物）；

　　b.仅与固定液和柱温有关；

　　c.适用于：组成简单、已知范围的混合物；

　　d.选定一定基准物按文献报道的色谱条件进行实验，计算两组分的相对保留值；

　　e.选择易得到纯品，与分析组分保留至相近的作基准物质；

　　f.不受柱长、固定相填充情况、固定液用量、载气的流速影响。

　　（4）根据保留指数定性 利用已知物的文献保留值与未知物的测定保留值对照，与柱温和固定相性质有关

　　式中：n和n+1个碳原子的正构烷烃，待测物质的tR(x)′ 恰在两个正构烷烃的 tR(n)′ 之间tR(n)′ ＜ tR(x)′ ＜ tR(n+1)′ 如求乙酸乙酯的保留指数，选正庚烷、正辛烷两个正构烷烃，未知的化合物的峰在此两个正构烷烃峰的中间。

　　3. 利用双柱或多柱定性

　　对于复杂样品的分析，利用双柱或多柱法更有效、可靠，使原来一根柱子上可能出现相同保留值的两种组分，在另一柱上就有可能出现不同的保留值。

　　同分异构体在同一色谱柱上保留值相同,极性不同的色谱柱，极性相差越大，保留值相差也越大，非极性柱与极性柱配合使用，同系物的保留值在两根不同极性色谱柱上呈线性关系非极性柱上，各物质按沸点高低出峰，极性柱上由化合物结构决定两个纯物质在性能不同的两根或多根色谱柱上有完全相同的保留值，为同一物质改变色谱条件，添加标准物质，对比色谱条件改变前后样品中组分的分离结果。

　　4. 联用方法定性

　　色谱-质谱联用：灵敏度高，扫描快，给出分子量

　　色谱-傅里叶变换红外光谱联用：GC-FTIR 有机化合物的结构分析、官能团定性有大量的标准图谱可查。

　　色谱-核磁共振联用：GC-NMR

　　定量分析方法

　　色谱定量分析是根据检测器对溶质产生的响应信号与溶质的量成正比原理，通过色谱图上的面积或峰高，计算样品中溶质的含量。

　　1. 峰面积测量方法

　　对于不同峰形的色谱峰采用不同的测量方法。

　　包括：

　　⑴ 峰高乘半峰宽法；

　　⑵ 峰高乘峰低宽度法；

　　⑶ 峰高乘平均峰宽法；

　　⑷ 峰高乘保留时间法；

　　⑸ 自动积分仪法。

　　只介绍常用两种。

　　① 对称形峰面积的测量: 峰高乘半峰宽法

　　理论上可以证明，对称峰的面积

　　A = 1.065×h×W1／2

　　② 不对称峰面积的测量: 峰高乘平均峰宽法

　　A = 1/2×h（W0.15＋W0.85）

　　式中W0.15和W0.85分别为峰高0.15倍和0.85倍处的峰宽。包括（前伸或拖尾）面积的测量。

　　2. 定量校正因子

　　为什么要测定定量校正因子？

　　色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比关系。但是由于同一检测器对不同的物质具有不同的响应值，即对不同物质，检测器的灵敏度不同，所以两个相等量的不同物质出的峰面积往往不相等，这样就不能用峰面积来直接计算物质的含量。为了使检测器产生的响应信号能真实地反映出物质的含量，就要对响应值进行校正，因此在定量计算时引入定量校正因子，使组分的峰面积转换成相应物质的量。

　　校正因子的表示方法：

　　⑴ 绝对校正因子：某组分 i 通过检测器的量与检测器对该组分的响应信号（峰面积或峰高）之比。

　　式中mi 为组分i的量，它可以是质量，也可以是摩尔分数或体积（对气体）。

　　绝对校正因子随着色谱操作条件而变，受到限制。

　　⑵ 相对校正因子：由于绝对校正因子受仪器及工作条件的影响，在实际工作中，采用相对定量校正因子。定义：样品中i 组分与标准物的绝对校正因子之比。用下式表示：

　　式中 m 和 A 分别代表质量和面积，下标 i 和 s 分别代表待测组分和标准物质。

　　TCD标准物用苯，FID用正庚烷。

　　fis表示相对质量校正因子，与检测器类型有关，而与检测器的具体结构、色谱操作条件无关。

　　3. 常用的定量分析方法

　　有 (1) 外标法；(2) 内标法；(3) 归一化法

　　(1) 外标法 (标准曲线法)

　　外标法又叫定量进样–标准曲线法。分析时首先将待测组分的纯物质配成不同浓度的标准溶液(液体样品用溶剂稀释，气体样品用载气稀释)，然后取固定量的标准溶液进行分析，从所得色谱图上测出峰面积或峰高，然后绘制响应信号(纵坐标)对浓度(横坐标)的标准曲线。

　　当待测试样浓度变化范围不大时，可不必绘制标准曲线，而采用单点校正法。即配制一个和待测组分含量十分接近的标准溶液定量进样，用待测组分和外标组分峰面积(或峰高)比来求待测组分的含量，即

　　因为Cs与As均为已知，令 Ki = Cs /As，则 Ci = Ki*Ai

　　此法是假定标准曲线通过坐标原点的，因此可由一点决定这条直线，Ki即为此直线的斜率，因而称为单点校正法。

　　外标法的优点：操作简单、计算方便，一个曲线可测多个试样，但一定要保证进样的重现性和操作条件的稳定性，两者对分析结果的准确度有着十分重要的影响，不需要知道校正因子。

　　⑵ 内标法

　　当只需测定试样中某几个组分，且试样中所有组分不能全部出峰时，可采用此法。

　　内标法：将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称取的试样中，根据待测物和内标物的重量及其在色谱图上相应的峰面积比，求出某组分的含量。

　　内标标准曲线法：

　　待测组分的纯物质配制梯度浓度标准溶液,取相同体积标液加入同样量的内标物，在相同的色谱条件下分析以浓度为横坐标，以待测组分和内标物的响应值之比为纵坐标，得到标准曲线。相同条件分析样品内标法的优点是定量准确，不象归一化法有使用上的限制。缺点是每次分析都要称取样品和内标物的重量，不适于作快速控制分析。

　　内标物的选择颇为重要，一般应具备如下几个条件：

　　① 内标物和试样应互溶，但无化学反应；

　　② 内标物与试样组分的峰能分开，内标物和待测物峰靠近；

　　③ 加入内标物的量应接近于待测组分的量；

　　④ 内标物与待测组分的物理化学性质相近，稳定；

　　⑤ 样品中不含有内标物。

　　外标法用的标准是自己，而内标法用的标准是别人。

　　（3）归一化法:

　　当试样中各组分都能流出色谱柱，并在色谱图上显示色谱峰时，可用此法进行定量计算。

　　设试样中有n个组分，各组分的量分别为m1，m2，…，mn，各组分含量的总和m为100%，其中组分 i 的百分含量Pi%可按下式计算：

　　fi 为质量校正因子，得到质量分数；如为摩尔校正因子，则得摩尔分数或体积分数（气体）。

　　若各组分的值f 相近或相同，例如同系物中沸点接近的各组分，则上式可简化为

　　对于狭窄的色谱峰，也有用峰高代替峰面积来进行定量测量。当各种操作条件保持严格不变时，在一定的进样量范围内，半峰宽不变，可用峰高代替峰面积进行定量。这种方法快速简便，最适合工厂和一些具有固定分析任务的化验室使用。即

　　fis 为峰高校正因子。

　　归一化法的优点：简单、准确，当操作条件（进样量、载气流量等）变化时，对结果影响小。不用标准，只进一次样。但此法在实际应用中仍有一些限制，如样品的全部组分必须流出且出峰，某些不需要定量的组分也必须测出其峰面积及 f 值等。

　　定量分析方法总结：

　　如果大家还想了解详细课程，可以在原地址观看回放，或到实验与分析网站http://lab.vogel.com.cn/lanniao观看。

　　（本文作者：王素利河北北方大学教授；编辑：小析姐）