甲醇芽孢杆菌蛋白酶的水解特性及酪蛋白水解产物活性分析

微生物蛋白酶是细菌、酵母或者霉菌等一些微生物生长过程中产生的酶；由于微生物繁殖速率快、生长条件易于控制、具有良好的稳定性和特异性等优点，该类蛋白酶己经成为工业应用中的主要酶制剂来源。本实验所用的甲醇芽孢杆菌LB-1蛋白酶是一种从黄酒麦曲中分离出的具有较高凝乳活力的蛋白酶，含有759 个氨基酸，分子质量为80.37 kDa，pI值为9.23，最适凝乳温度和pH值分别为50 ℃和6.5。该酶应用于马苏里拉干酪加工中具备部分代替商业凝乳酶的潜力。但是该酶的蛋白水解活力包括引起凝乳的关键水解位点、水解产物活性等仍鲜有深入研究。

北京食品营养与人类健康高精尖创新中心的杨智杰、郑喆和杨贞耐*等人旨在了解蛋白酶LB-1的蛋白水解特性，特别是其蛋白水解的最适条件及稳定性、引起凝乳的关键水解位点，并对其酪蛋白水解产物的生物活性进行评价。以期为具有凝乳作用的甲醇芽孢杆菌蛋白酶在乳制品加工中的应用，以及该酶酪蛋白水解产物在功能性食品领域的研究开发提供理论支持。

1 不同条件对蛋白酶LB-1水解活力的影响

1.1 温度和pH值的影响

由图1A可以看出，水解活力在27～62 ℃之间呈现出先缓慢上升再骤降的趋势，在62 ℃时蛋白水解活力降至最低26.2 U/mL。在52 ℃时，蛋白水解活力达到最大值46.49 U/mL，且温度低于55 ℃时，蛋白酶LB-1具有较好的热稳定性。由图1B可知，当pH值在5.5～6.0范围变化时，蛋白水解活力随着pH值增加快速上升，在pH值大于7.0时，蛋白水解活力稍有下降之后趋于平缓。说明此酶在弱酸性的条件下（pH 6.0～7.0）拥有较高的蛋白水解活力。

1.2 添加物的影响

结果显示，大部分添加物，如单价阳离子（K+、Na+、Li+）、部分二价阳离子（Zn2+、Mg2+、Ca2+）、甲醇、乙醇、乙腈、二甲基亚砜、尿素、非离子去污剂曲拉通-100溶液，对蛋白酶活性影响较小，相对水解活力均保持在95%以上，没有明显的抑制作用。少数添加物对蛋白酶水解活力影响较大，如Cu2+使相对活力微弱降低至92.23%；异丙醇使酶的相对活力降低至82.13%；而重金属离子（Cd2+、Pb2+）、阴离子洗涤剂SDS尤其是Pb2+和SDS几乎使酶失活，蛋白酶的相对水解活力仅剩10%左右。上述结果表明Cu2+对该蛋白酶水解活力产生了负面影响，但不是该蛋白酶的高效抑制剂。

2 蛋白酶LB-1对乳清蛋白和酪蛋白的水解作用对比

如图2A、B所示，在水解开始后的360 min内，乳清蛋白和酪蛋白的pH值均不断降低，分别由最初的6.52和6.66降至6.39和6.33。前30 min的pH值下降迅速，之后趋于缓慢。乳清蛋白的ORP在水解时间内，呈现先降低后缓慢升高的趋势，并于水解第140分钟时达到最低点（91.45 mV）。酪蛋白的ORP则呈现出先迅速下降，再快速上升的趋势，在水解第50分钟时达到最低值（137.86 mV），最终ORP值（172.64 mV）与初始值（176.88 mV）相差不大。

如图2C所示，蛋白酶LB-1对乳清蛋白水解360 min内均未产生明显小于10 kDa的水解产物，随着时间的延长略有水解，但作用不明显。改变蛋白酶LB-1质量浓度后，对乳清蛋白水解过程SDS-PAGE分析的结果（图2E）显示，各电泳条带依旧无明显变化。

如图2D所示，随着水解时间延长，酪蛋白条带逐步消失，水解产物丰富。水解120 min后（第6泳道），25～30 kDa的酪蛋白基本水解完全，水解360 min后（第8泳道）基本只有水解产物存在。位于10～15 kDa和小于10 kDa的水解产物从水解5 min后（第2泳道）开始出现，含量随着时间延长逐步增加。从第120分钟开始出现了分子质量更小的水解产物，并在水解360 min后产量达到最大值。改变蛋白酶LB-1质量浓度（图2F），酪蛋白的水解程度随着酶质量浓度上升而逐步增大，在5 mg/mL（第6泳道）的酶质量浓度下，水解产物大量生成，在酶质量浓度增加至10 mg/mL（第7泳道）时，底物被完全水解。当酶质量浓度增加至20 mg/mL（第8泳道）时，大部分水解产物也会被进一步分解。

蛋白酶LB-1对乳清蛋白的水解作用并不明显，不同酶质量浓度下各泳道的蛋白条带没有明显变化，表明蛋白酶LB-1对乳清蛋白的水解活力比较低，且提高酶质量浓度也不能有效提高乳清蛋白水解程度；而绝大部分酪蛋白经过180 min己被水解完，说明酪蛋白拥有蛋白酶LB-1的多个水解位点，数量远大于乳清蛋白，且随着酶质量浓度的增大，酪蛋白的水解程度逐步增大，表明分解酪蛋白产生的肽段当中依旧存在酶的水解位点。本研究选取3 种酪蛋白标准品进行了进一步水解分析，以探究该酶具体的作用蛋白。

3 蛋白酶LB-1对不同酪蛋白标准品的水解作用对比

随着蛋白酶质量浓度从0 mg/mL增加到1 mg/mL，β-酪蛋白无明显变化（图3B），所有条带均与0 mg/mL时保持一致，α-酪蛋白（图3A）和κ-酪蛋白（图3C）水解明显。在1 mg/mL（第8泳道）的质量浓度下，α-酪蛋白和κ-酪蛋白几乎水解完全，对应条带消失。但是α-酪蛋白的水解产物稳定性较差，在1 mg/mL（图3B第8泳道）的酶质量浓度下产物降解为更小的肽段，对应条带消失。κ-酪蛋白（图3C）在较低酶质量浓度0.031 25 mg/mL时（图3C第2泳道）产生了一条明显的蛋白水解条带，分子质量大小约为11 kDa。

上述结果表明，LB-1蛋白酶对β-酪蛋白的水解不敏感，对α-、κ-酪蛋白的水解具有较高的活性。但是α-酪蛋白的水解产物稳定性较差，只有κ-酪蛋白具有存在于整个水解过程的水解产物，说明该蛋白条带为蛋白酶LB-1水解κ-酪蛋白的主要水解产物。由于该条带与凝乳酶使牛乳凝乳后所产生的副κ-酪蛋白分子质量接近（12.268 kDa），该主要肽段的生成很有可能是蛋白酶LB-1具有凝乳作用的关键。因此对κ-酪蛋白进行进一步的水解位点分析。

4 蛋白酶LB-1对κ-酪蛋白的水解位点分析

将蛋白酶LB-1水解κ-酪蛋白得到的主要肽段（约11 kDa）用胰蛋白酶酶解，将酶解片段进行液相色谱-串联质谱指纹图谱分析，结果显示，胰蛋白酶酶解得到12 条肽段，所有肽段均以赖氨酸或精氨酸结尾，符合胰蛋白酶的水解规律。从图4可以看出，κ-酪蛋白裂解出的主要肽段中，多肽肽段序列从κ-酪蛋白氨基端的第22位异亮氨酸开始，到第112位的赖氨酸结束，且未检测到113位的天冬氨酸残基，表明蛋白酶LB-1对κ-酪蛋白的水解位点主要有2 个，分别为Lys21-Ile22和Lys112-Asn113。这个主肽含有90 个氨基酸，分子质量为10.537 kDa，这与凝胶电泳分析（图3C）的大小一致。

5 蛋白酶LB-1水解酪蛋白的产物活性分析

5.1 酪蛋白水解产物抗氧化活性分析

结果显示，水解0 h的酪蛋白具有62.58%的DPPH自由基清除率，在水解的前6 h，DPPH自由基清除能力随着酪蛋白水解程度的升高而逐步升高，达到最大清除率75.4%，上升了12.81%。在第9小时趋于稳定，第12小时略有降低。各水解产物的ABTS阳离子自由基清除率较第0小时均有升高，其中3～9 h清除率稳定在42%左右，第12小时到最大值48.45%，清除率相对升高了13.75%。

5.2 酪蛋白水解产物降血糖活性分析

结果显示，蛋白酶LB-1水解酪蛋白所有时间段的酶抑制率均在70%以上，能够起到良好的酶抑制作用。加入蛋白酶后，不同水解时间产物的α-淀粉酶抑制率均有不同程度的升高，第1小时和第6小时的抑制率最高，均在80.89%，相对增高了7.65%。α-葡萄糖苷酶的抑制率在第0小时只有13.81%，水解开始后，抑制率迅速上升，3 h后水解程度和α-葡萄糖苷酶抑制率不断升高，在第12小时达到最大值93.12%，相比第0小时上升了79.31%。经水解后的酪蛋白相比第0小时未水解酪蛋白的α-葡萄糖苷酶抑制率均有明显增加，说明蛋白酶LB-1水解酪蛋白产生的多肽对α-葡萄糖苷酶的抑制作用十分明显，且肽段越小抑制作用越强。

抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性能够降低餐后血糖水平，减缓淀粉的消化与分解，这对II型糖尿病患者和边缘性糖尿病患者具有积极作用。目前己有类似研究发现，酪蛋白水解产生的含有7 个氨基酸残基的寡肽（YPFPGPI）能够抑制小肠对葡萄糖的吸收从而达到降血糖的目的。

5.3 酪蛋白水解产物金属螯合活性分析

结果显示，第3小时和第12小时的钙离子螯合率在40%以下，其他时间水解产物螯合率都在55%以上，第9小时螯合率最高达到63.13%，第12小时最低只有36.27%。锌离子螯合率与钙离子的趋势相类似，但螯合率均比钙离子低。水解第0小时的螯合率（33.26%）仅次于第9小时（35.31%），第12小时最低为25.83%。

钙离子、锌离子的螯合需要多肽上特定的氨基酸序列或者氨基酸残基提供的结合位点，12 h的长时间水解己经使大部分水解产物多次水解，仅剩小分子肽段，造成与金属螯合率降低。而对于0 h的酪蛋白而言，其本身就具备一定的金属结合能力，且大分子的蛋白结构，亦有可能会对金属离子进行掩埋，从而造成螯合率较高的现象。但是，酪蛋白在肠胃进行消化时，会失去原有结构以及序列，导致螯合的金属离子无法被肠道直接吸收利用，而无法达到金属补充剂的目的。

结 论

本研究测定了甲醇芽孢杆菌蛋白酶LB-1在不同温度、pH值、添加物条件下的水解活力，结果表明该蛋白酶最适水解温度为52 ℃，最适pH值为6.0～7.0，对大部分金属离子、有机试剂、变性剂和洗涤剂表现出了较高的稳定性。

分别以乳清蛋白和酪蛋白为底物进行的水解实验表明，蛋白酶LB-1对乳清蛋白的水解不明显，但对酪蛋白水解作用显著。以α-、β-、κ-酪蛋白标准品作为底物进行的水解实验进一步表明，该酶对κ-酪蛋白具有较高的水解活力和水解产物稳定性，水解位点主要位于Lys21-Ile22和Lys112-Asn113，得到分子质量为10.537 kDa的主要肽段。

对蛋白酶LB-1在最适条件下水解酪蛋白的产物进行生物活性分析，结果表明其DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除率分别可达75.4%和48.45%，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的最高抑制率分别为80.89%和93.12%，钙离子和锌离子的最高螯合率分别为63.13%和35.31%；表明该酶具有一定的抗氧化能力和降血糖作用，以及良好的金属离子螯合能力。甲醇芽孢杆菌蛋白酶LB-1水解酪蛋白的产物可作为新型功能性食品配料，在功能性干酪加工和乳源活性肽开发方面具有潜在的应用价值。

本文《甲醇芽孢杆菌蛋白酶的水解特性及酪蛋白水解产物活性分析》来源于《食品科学》2020年41卷14期153-160页，作者：杨智杰，郑喆，蔡淼，赵笑，罗天淇，黎润坤，陈超，曹永强，杨贞耐。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190629-398。点击下 阅读原文 即可查看文章相关信息。

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