《食品科学》：宁夏大学李亚蕾教授等：秦川牛宰后成熟过程中线粒体Tu翻译延长因子对牛肉持水性的影响

宰后初期，牛肉组织细胞内的某些细胞因子如低氧诱导因子1（HIF-1）等被激活，可通过细胞自噬或细胞凋亡来恢复体内平衡和组织生存，该过程将直接或间接影响肉的持水性。

自噬是肌肉到肉转化过程中的一种自然反应，有研究表明，细胞自噬发生在猪肉成熟的整个过程中，可以改变肌纤维的纵向分裂速率，对肉品质有重要影响。 线粒体Tu翻译延长因子（TUFM）是一种线粒体自噬因子，可启动线粒体自噬和清除受损线粒体，促使线粒体损伤信号通路诱导的细胞凋亡减弱 。

宁夏大学食品科学与工程学院司健芳、张静、李亚蕾*等通过测定牛背最长肌宰后成熟过程中的贮藏损失、离心损失、蒸煮损失、水分分布、TUFM含量、Beclin1蛋白表达量、肌原纤维蛋白等指标的变化，探究TUFM与持水性之间的关系，同时采用4D-非标记定量（4D-LFQ）蛋白质组学技术分析不同成熟期秦川牛背最长肌蛋白质水平变化，筛选与TUFM相关的差异蛋白，分析其富集到的通路是否影响肉品质，并确定TUFM相关差异蛋白中与持水性相关的差异蛋白，旨在为调控宰后牛肉成熟提供理论依据。

1

秦川牛宰后成熟期间pH值、贮藏损失、离心损失及蒸煮损失的变化

如表1所示，宰后初期，pH值在0～12 h急速下降，12～96 h下降较为缓慢，最终降低到5.49，该过程肌细胞的能量供应从有氧代谢转变为厌氧糖酵解以维持代谢活动，pH值的降低可能是由于糖原的厌氧转化导致乳酸积聚，随着乳酸的积累，肉中H + 浓度升高，pH值降低，同时肌浆网中释放的Ca 2+ 会激活钙蛋白酶，使其分解肌源性蛋白质以产生一些碱性物质，也会在一定程度上提高pH值，因此在96～192 h，pH值上升到5.76。pH值变化趋势与Xin Keqi等研究牦牛宰后成熟期间pH值的变化趋势一致。

有研究表明，贮藏损失主要取决于宰后代谢。0～96 h，贮藏损失随牛肉成熟时间的延长而增加，从0 h时的0.13%上升到96 h时的6.40%，其中24～48 h上升最快（

P

＜0.05），96 h为贮藏损失的最高点，这是由于表面张力较为微弱的自由水易以贮藏损失的形式从肉中排出，从而使水分在一定时间内快速减少。贮藏损失在96～192 h呈现显著下降趋势（

P

＜0.05），最终下降至192 h时的3.43%。这时肌原纤维间隙的扩大需要细胞外的水重新浸润到细胞中，因此贮藏损失有所降低。贮藏损失整体趋势与Xin Keqi等 的研究结果一致。

离心损失是指在离心力的作用下样品损失的水分，可反映肌肉的持水性。研究表明，低速离心法比贮藏损失法损失的水分更多。秦川牛在宰后0～96 h的离心损失呈上升趋势，这是因为随着牛肉成熟时间的延长，蛋白质变性导致肌肉纤维中的水分流失。其中，0～96 h的离心损失显著增加（

P

＜0.05），这是由于在宰后早期肉僵直，无法保留大量水分，与Li Haijing等 研究一致。96～192 h的离心损失明显下降是由于牛肉逐渐成熟，解除僵直。192 h的离心损失逐渐恢复到24 h的水平，与张萌等 的研究结果一致。

在宰后前期，蒸煮损失率逐渐增加，直至96 h达到峰值，这是因为蒸煮过程中肌肉纤维发生横向热收缩、Z线蛋白降解，使肉中水分受到挤压排出 。在96～192 h，蒸煮损失下降，这是由于肌原纤维蛋白降解导致肌肉结构较差，因此在蒸煮过程中水分容易流失，与Jaspal等 的研究结果一致。

2

秦川牛宰后成熟期间水分分布的变化

LF-NMR模向弛豫时间（

T

2 ）反映水和底物之间的紧密程度，可反映宰后成熟过程中水分分布对肉类持水性的影响。

T

2b 、

T

21 和

T

22 分别表示与蛋白质结合的结合水、肌纤维网络中的水和自由水 。峰面积比

P

2b 、

P

21 和

P

22 分别代表

T

2b 、

T

21 和

T

22 对应状态水的相对含量。Qian Shuyi等 发现

T

2 与猪肉品质特征之间存在相关性，证明肉样的 T 2 较长时，持水性较差。由表2可知，

P

2b 和

P

22 均小于5%，而

P

21 始终大于95%。这表明肌纤维网络中的水是牛肉中水分的主要存在状态，且不易流失，与Guo Zhaobin等 研究一致。同时可以看出成熟时间为96 h时，

P

21 最低，

P

22 最高，表明部分肌纤维网络中的水在宰后96 h可转化为自由水，牛肉在宰后96 h的持水性较差。

3

秦川牛宰后成熟期间肌原纤维蛋白的降解

研究表明，宰后成熟过程中肉品质变化与肌原纤维蛋白的降解有关。由图1可知，宰后初期条带较少且清晰，随着成熟时间的延长，部分条带逐渐变深，部分条带发生降解，如20～35、40～70 kDa处条带，28～30 kDa降解片段的出现可作为持水性和嫩度变化的标志。40～70 kDa中整联蛋白、结蛋白等降解会影响肉的持水性，TUFM（49 kDa）、Beclin1（60 kDa）蛋白也在40～70 kDa条带中。综上，肌原纤维蛋白在宰后发生降解，其变化可能会影响肉的持水性，与马旭华等的研究结果一致。

4

秦川牛宰后成熟期间Beclin1蛋白表达量的变化

宰后成熟过程中，肌肉蛋白降解主要受Beclin1、微管相关蛋白1轻链3β（LC3）等调节的自噬溶酶体途径的影响 。Beclin1是参与自噬启动的关键蛋白，也是自噬的关键标志物，为了进一步研究宰后成熟过程中牛肉是否发生细胞自噬，采用免疫印迹法测定Beclin1蛋白表达量。由图2可知，Beclin1蛋白的表达量在牛肉成熟过程中呈先上升后下降的趋势，0～96 h Beclin1条带逐渐变深，与贾旭 研究发现的羊肉初期成熟过程中会发生细胞自噬且Beclin1的表达水平随着成熟时间的延长呈逐渐上升趋势的结果一致，由此推测Beclin1蛋白表达量的上升可能是肌肉细胞发生自噬作用，以清除受损的细胞器，保护细胞免于死亡并维持细胞稳态。96～192 h Beclin1蛋白表达下降，与此同时，肌原纤维蛋白也发生降解，在该成熟过程Beclin1蛋白表达量的下降会消耗自噬能力，并且可能会增加细胞凋亡水平，与Zhou Ao等 的研究结果趋势一致。综上所述，在宰后成熟过程中，牛肉组织中有活跃的Beclin1，故秦川牛宰后正常成熟过程中发生了细胞自噬。

5

秦川牛宰后成熟期间蛋白质组学分析

采用4D-LFQ测定不同成熟期牛背最长肌的蛋白质组表达情况，以差异倍数（FC）＞1.3或FC＜1/1.3且

P

＜0.05为标准筛选差异蛋白，如图3所示，共鉴定出97 种显著差异蛋白。96 h与0 h相比鉴定出30 种差异蛋白，其中15 种显著上调、15 种显著下调（图4a）。192 h与0 h相比鉴定出62 种差异蛋白，其中33 种显著上调、29 种显著下调（图4b）。192 h与96 h相比鉴定出31 种差异蛋白，其中16 种显著上调、15 种显著下调（图4c），表明样本蛋白质组表达较为稳定。

6

秦川牛宰后成熟期间TUFM表达量、含量的变化

如图5所示，TUFM表达量呈先上升后下降趋势。TUFM含量整体变化与TUFM表达量变化趋势一致，再次表明在宰后成熟过程中，TUFM表达量呈先上升后下降趋势。有研究表明，在宰后牛肉细胞缺氧环境中，TUFM表达量减少时，细胞自噬也减少。在0 h时，TUFM表达量偏低，这是由于氧气供应突然被切断，线粒体呼吸受到抑制，TUFM刚被激活时，细胞的自噬过程并不强烈。随着宰后牛肉的逐渐成熟，TUFM的表达量从0 h的1.01上升至96 h的1.15（

P

＜0.05），此时，乳酸大量积累，TUFM快速正向调节细胞自噬，维持细胞活性 。成熟后期，由于肌肉细胞能量物质供应不足，TUFM表达量下降到0.97（

P

＜0.05），该过程可能减弱宰后成熟后期肌肉细胞自噬，并促进细胞凋亡，这与罗辉等 的研究结果一致。

7

秦川牛宰后成熟期间TUFM表达量和Beclin1蛋白表达量与牛肉持水性之间的Pearson相关性分析

对TUFM表达量和Beclin1蛋白表达量及牛肉持水性指标进行Pearson相关性分析，结果表明，宰后成熟期间TUFM表达量与Beclin1蛋白表达量、贮藏损失、离心损失、蒸煮损失、水分分布均存在显著相关性（表3）。牛肉TUFM表达量与

P

2b 呈极显著正相关（

r

＝0.878，

P

＜0.01），与贮藏损失（

r

＝0.698）、离心损失（

r

＝0.667）、蒸煮损失（

r

＝0.739）呈显著正相关（

P

＜0.05），与

P

21 呈极显著负相关（

r

＝-0.813，

P

＜0.01），与

P

22 呈显著负相关（ r ＝-0.708， P ＜0.05），与pH值无显著相关性（

r

＝-0.494，

P

＞0.05）。如上所述，TUFM与持水性指标较高的相关系数证明秦川牛在宰后成熟期间TUFM表达量的变化与持水性有密切关系；牛肉TUFM表达量与Beclin1蛋白表达量呈极显著正相关（ r ＝0.901， P ＜0.01），说明TUFM与自噬之间存在重要联系。有研究表明，在宰后成熟过程中，Beclin1蛋白表达量对肉品质有影响 。由此可见，宰后成熟期间TUFM可能通过参与细胞自噬进而影响牛肉持水性。

08

秦川牛宰后成熟期间TUFM相关差异蛋白的筛选

根据蛋白质功能，筛选出23 种与TUFM表达相关的差异蛋白，如表4所示。

蛋白质组学分析表明，在4 ℃成熟过程中，包括TUFM在内，共筛选出24 种差异蛋白，其中，ATP5F1C、ATP5F1D、EIF3B、EIF4E、EIF6、GSPT1、NDUFA6、RPS16共8 种蛋白上调，ALDOC、COX7A1、EEF1A1、EEF1A2、EEF1B、ENO2、NDUFA4、NDUFB5、PSMB6、TCP1、TUFM、SOD2、SUCLA2、SUCLG1共14 种蛋白下调。CCT7、HSPA6这2 种蛋白分别在96 h与0 h相比、192 h与0 h相比时均下调，192 h与96 h相比时均上调。经查询UniProt数据库可知，ALDOC、ATP5F1C、ATP5F1D、COX7A1、ENO2、NDUFA4、NDUFA6、NDUFB5、PSMB6、SOD2、SUCLA2、SUCLG1这12 种差异蛋白与TUFM蛋白一样均与线粒体密切相关，可能通过在线粒体中发挥作用，进而影响能量代谢和氧化应激，最终影响肉品质 。其余差异蛋白主要与真核翻译因子、热休克蛋白有关，可能通过进行细胞自噬和细胞凋亡，进而影响肉品质 。

9

GO和KEGG通路功能富集分析

利用GO注释对筛选出的TUFM及相关差异蛋白进行生物信息学分析，并从生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）3 个角度分析其功能，如图6所示，共富集13 个BP、10 个CC、10 个MF。相关差异蛋白主要富集的BP包括翻译、平移伸长、转化启动、糖酵解、氧离子跨膜转运等；CC包括线粒体、线粒体质子转运ATP合酶复合物，催化核心F1、线粒体质子转运ATP合酶复合物、线粒体呼吸链复合物IV、细胞体等；MF有平移伸长因子活性、参与蛋白质折叠的蛋白质结合、翻译起始因素活动、未折叠蛋白结合、蛋白质结合等。综上可知，相关差异蛋白与线粒体部分复合物有关，主要参与翻译、氧转运、糖酵解等途径。有研究表明，TUFM表达下调导致肌肉细胞自噬减弱是由于线粒体能量代谢异常、ATP能量供应不足。从图6可以看出，ALDOC、ENO2等参与糖酵解、氧转运过程的一簇蛋白质逐渐减少，呈下调趋势，该过程产生的ATP可用于解除宰后成熟后期牛肉的僵直。因此，TUFM及相关差异蛋白可能通过下调部分蛋白产生能量进行细胞自噬，从而使肌肉状态发生变化，这些变化与肉品质密切相关。

为了阐明这些蛋白参与的代谢途径，进行KEGG富集。如图7所示，24 种差异蛋白在7 条通路中显著富集，TUFM及相关差异蛋白主要参与的通路是活性氧、氧化磷酸化、碳代谢、代谢途径。在牛肉宰后成熟过程中，与三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环途径和代谢途径有关的差异蛋白数目相比，氧化磷酸化途径的显著差异蛋白更多，与Liu Chunmei等 发现的线粒体蛋白在氧化磷酸化通路中显著富集的结果一致。此外，由于宰后缺氧，肌肉的细胞环境发生改变，部分差异蛋白参与氧转运途径，同时从氧化磷酸化途径转变为糖酵解途径以产生ATP，为细胞自噬提供能量 。

10

TUFM及相关差异蛋白PPI分析

图8为TUFM及23 种差异蛋白的PPI分析图。其中，网络节点代表差异蛋白，连线代表蛋白质之间的关系。共有24 个节点，72 条边，6 个平均节点度，平均局部聚类系数为0.7，预期边数为21，PPI富集

P

＜1.0×10 -16 浓 。TUFM主要与PSMB6、CCT7、EIF6、RPS16、ENO2、SOD2、SUCLA2、SUCLG1、ATP5F1C、ATP5FID这10 种差异蛋白直接连接，与剩余13 种差异蛋白间接连接。这些差异蛋白主要与线粒体和能量代谢有关，可能参与细胞自噬，影响肉品质。这与GO富集分析结果一致。

11

宰后成熟过程中TUFM相关差异蛋白与持水性相关性分析

上述研究已证明TUFM表达量与持水性存在显著相关性（

P

＜0.05），并通过GO注释、KEGG通路分析和PPI分析了解到TUFM及相关差异蛋白与肉品质之间存在密切关系，对筛选出的差异蛋白与持水性进行相关性分析，确定与持水性相关的差异蛋白。如图9所示，多种蛋白与持水性有显著相关性。

由表5可知，筛选出与TUFM相关的23 种差异蛋白中，共5 种蛋白与持水性理化指标有显著相关性（

P

＜0.05），其中ATP5F1D、NDUFB5与宰后牛肉的持水性指标均呈显著相关（

P

＜0.05、

P

＜0.01），ATP5F1D全称ATP合酶亚基δ，是一种线粒体质子转运ATP合酶复合物，主要以质子为动力，驱动线粒体ATP合成，在宰后初期能量代谢中发挥作用。NDUFB5是NADH的一个亚基，位于线粒体内膜，具有NADH脱氢酶和氧化还原酶活性，可以将电子从NADH转移到呼吸链 。在宰后初期缺氧时，牛肉中ATP增加，为肌肉细胞提供能量，细胞发生自噬作用时，2 种蛋白表达水平发生改变，可选择性删除功能失调的线粒体 ，进而影响肉的持水性。这与Zou Bo等 研究发现的能量代谢、线粒体变化和持水性有关的结果一致。

GSPT1即G1至S期相变1，也称为真核释放因子3A，是转换终止的必要释放因子，参与各种细胞过程，如细胞周期进程、细胞自噬和细胞凋亡 。GSPT1蛋白的上调抑制了自噬体的积累和成熟 。真核翻译延长因子EEF1A2是EEF1A复合物的一种亚型，与涉及自噬过程的溶酶体有关，在细胞骨架组织、细胞自噬等过程中也起作用 。一般而言，EEF1A2表达降低，自噬减少。SUCLG1主要与TCA循环和线粒体有关，具有普遍的表达形式 。综上可知，这5 种差异蛋白与TUFM一样，均为翻译因子，在背最长肌中高度表达，并且都参与氧转运途径，在细胞自噬中发挥作用，调控牛肉细胞的生长、增殖和发育，从而影响肉的持水性。

12

结论

在秦川牛宰后成熟期间，肌原纤维蛋白发生降解，TUFM表达量及含量、Beclin1蛋白表达量、贮藏损失、离心损失、蒸煮损失、水分分布整体均呈先上升后下降趋势，pH值呈先下降后上升趋势。对以上指标进行相关性分析，结果表明，秦川牛肉宰后成熟期间TUFM参与细胞自噬，并与持水性存在密切相关性。利用蛋白质组学技术分析发现，与TUFM相关的23 种差异蛋白主要与线粒体和翻译因子有关，主要通过参与氧化磷酸化和氧转运等途径介导细胞自噬，进而影响肉品质。其中TUFM、ATP5F1D、EEF1A2、GSPT1、NDUFB5、SUCLG1 6 种差异蛋白与持水性有显著相关性（

P

＜0.05、

P

＜0.01），通过能量代谢和氧转运等途径介导宰后成熟过程中的肌肉细胞自噬，从而影响肉的持水性。本研究结论可为研究TUFM蛋白在宰后成熟过程中发挥的作用提供理论依据。

本文《秦川牛宰后成熟过程中线粒体Tu翻译延长因子对牛肉持水性的影响》来源于《食品科学》2024年46卷第1期1-10页，作者：司健芳，张 静，高 爽，马佳荣，曹松敏，李亚蕾*，罗瑞明。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240115-126。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：梁雯菁；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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