基于甲基化模式估算ctDNA丰度的新方法TMeF

导 读

肿瘤负荷（tumor burden）指人体中癌细胞的数量、肿瘤的大小或癌症病灶的总量。肿瘤负荷与疾病结局相关，因此肿瘤负荷的评估可以指导肿瘤的临床管理。目前，衡量肿瘤负荷的方法很多，最常用的是CT成像，但这种方法有明显的局限性，肿瘤必须足够大，并且在正确的位置才能准确成像。

近年来，定量肿瘤负荷和捕获肿瘤生长动力学信息的颇具前景的方法是细胞游离DNA（cfDNA）分析。已有研究显示，血液中癌症衍生的cfDNA（即ctDNA）水平与多种癌症类型的肿瘤体积相关。与基于成像的肿瘤大小评估相比，ctDNA分析可以更好地告知风险分层和预后预测。循环中源自肿瘤并含有癌症相关等位基因的cfDNA被定义为循环肿瘤等位基因分数（cTAF）。cTAF是ctDNA的量度，因此近似于总体肿瘤负荷。各种ctDNA检测平台估计显示，较高的cTAF与较差的临床结局相关。

位点特异性DNA甲基化模式是细胞身份的特征性指标，包括肿瘤状态。肿瘤细胞中的DNA甲基化模式保存在ctDNA中，可指示癌症的存在以及癌症类型。前期已有研究评估了使用靶向测序、全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）和qPCR从cfDNA的甲基化模式估计cTAF的技术，这些方法中的大多数尚未应用于靶向甲基化数据，也没有证明对低浓度ctDNA的准确定量，这对于临床应用仍然不足。

GRAIL公司研究团队在Cancers发表了题为“A Novel Tissue-Free Method to Estimate Tumor-Derived Cell-Free DNA Quantity Using Tumor Methylation Patterns”的文章。研究团队开发了一种新的、灵敏的、无组织的统计方法来量化cfDNA的癌症指示性甲基化模式，以计算肿瘤甲基化分数（TMeF），评估低水平的ctDNA丰度。在不使用匹配组织活检的情况下，研究团队利用差异甲基化区域（DMRs）中与癌症指示性高/低甲基化模式匹配的片段计数来确定血浆样本的TMeF，发现TMeF随肿瘤分期和肿瘤大小的增加而增加，与生存率呈负相关。因此，可以利用癌症患者cfDNA中的肿瘤来源片段估计ctDNA丰度，而无需进行肿瘤活检。

文章发表在Cancers

主要研究内容

基于DMRs区分癌症类型

通过评估DNA甲基化模式，研究团队识别了癌组织活检样本的参考数据库和非癌个体cfDNA之间的DMRs，以区分癌症和非癌症DNA片段。DMRs由至少五个连续CpG组成，其具有单一的癌症指示性甲基化模式，相对于非癌症cfDNA，这些CpGs的甲基化程度存在差异（图1a）。每个癌症组织活检样本和每个癌症标签分别鉴定了1911个和11683个DMRs（图1b）。DMRs在每个癌症标签中显示出广泛的患病率分布（图1c）。研究团队通过热图聚类，对癌症组织活检样本中的DMRs频率进行可视化，基于每个癌症标签鉴定的50种最普遍的DMRs显示了共享和癌症类型特异性DMRs的聚类（图2）。因此，DMRs可以区分肿瘤信号来源（CSO），这与之前观察到的MCED检测的高CSO预测精度一致。

图1.在癌症组织样本中发现的短DMRs。

图2. DMRs反映了癌症相关甲基化模式。

TMeF可准确定量ctDNA丰度

鉴定DMRs的一个目的是从血浆样本计算TMeF，而不需要匹配的组织测序。从血浆cfDNA计算的TMeF是cTAF和总体ctDNA丰度的量度。首先，为了评估在低ctDNA水平下TMeF评估的准确性，研究团队以各种稀释水平产生癌症和非癌症cfDNA样本的合成稀释液（图3a）。在预期TMeF为10-3时，95%的样本测得的TMeF在预期TMeF的0.5-2倍范围内；在预期TMeF为10-4时，77%的样本测得的TMeF在预期的0.5-2倍范围内。TMeF在10-5左右逐渐减少，因此，低于这个水平，目前无法准确估计cTAF。

图3.合成稀释分析评价TMeF线性。

接下来，研究人员评估了来自CCGA子研究2的42个治疗前实体瘤血浆样本中TMeF估值的准确性。样本代表了I-IV期的16种不同癌症类型。结果发现，这些样本的TMeF估值与小变异等位基因分数（SVAF）估值相关性良好，86%样本的TMeF估值在匹配SVAF估值的10倍范围内（图4）。

图4. DMRs能够准确进行等位基因分数评估。

TMeF与临床分期、肿瘤大小、总生存率相关

为了探索TMeF与肿瘤负荷之间的关系，研究团队在CCGA子研究3的预处理子集中计算TMeF，这些样本是通过算法训练和改进得到的实体瘤血浆样本。在这些样本中，TMeF随着不同癌症类型临床分期的增加而增加（图5a）。TMeF与多种癌症类型和亚型的原发肿瘤大小显著相关，包括结直肠癌、非小细胞肺癌、激素受体阳性和三阴性乳腺癌等。对于肾癌、卵巢癌和子宫癌，提示TMeF与肿瘤大小无关联。

最后，根据TMeF对纳入患者进行分层，结果发现，在不同癌症类型中，与较高TMeF的参与者相比，较低水平TMeF的参与者总体生存率更高（图5b、c）。对于所有TMeF分组，CCGA参与者观察到的总生存率优于基于性别、年龄、癌症类型和分期匹配的SEER（监测、流行病学和最终结果）人群的预期时间依赖性总生存率。在TMeF较低的分组中，患者死亡率与预期死亡率的倍数变化差异更大。在简单的Cox比例风险模型（图5c）中，TMeF较高的分组在晚期癌症中富集，TMeF较低的分组在早期癌症中富集，这与观察到的TMeF随癌症分期增加相一致（图5a）。当与临床分期和癌症类型联合建模时，较低的TMeF与更好的生存率显著相关，当添加到这些容易获得的临床数据中时，提示cTAF具有预后作用。

图5. TMeF与临床分期及生存率有关。

结 语

该研究描述了一种使用cfDNA甲基化模式估计cTAF的方法TMeF，提供了一种可选的量化肿瘤负荷的方法，并且TMeF估值与来自癌症患者的匹配血浆样本中cTAF的SVAF估值相关。重要的是，TMeF与临床癌症分期、肿瘤大小和总生存期相关，这表明其能够满足量化肿瘤负荷的预后需求。

基于甲基化的肿瘤负荷评估有很多优点：

1.基于血液的癌症检测方法较少依赖于肿瘤位置，最终可能在肿瘤大到可以通过成像检测到之前进行检测。

2.甲基化模式可以区分不同的癌症类型，在临床应用TMeF进行癌症检测和复发监测时，可用于指导诊断成像。

3.TMeF可以捕获癌症侵袭性和生长的其他临床标志物，可以提供更好的风险分层和预后预测。

4.ctDNA估计预计在不同个体之间和个体内部的肿瘤克隆进化中是稳健的。

5.在没有肿瘤组织的情况下，TMeF估计是可靠的，且保留了利用匹配组织的灵活性。

总之，TMeF是适用于研究生物流体中ctDNA丰度的广泛有用的度量。

研究团队证明了来自癌症患者血浆样本的TMeF可以用作cTAF的估值，而不需要匹配的肿瘤样本。在未来，ctDNA的TMeF估值可以应用于其他生物流体，如尿液，并且它可以用于各种临床应用，如早期癌症检测、预后预测、微小残留病和复发监测。

GRAIL团队在文章中写道：“由于用于计算多种癌症类型TMeF信号的广泛性，TMeF可能定量来自所有脱落癌细胞的ctDNA水平，无论是来自原发肿瘤还是转移部位，无论其克隆谱系如何。”

GRAIL首席财务官兼研究高级副总裁Amoolya Singh表示：“我们相信TMeF在治疗反应监测方面也有很大的潜力，最新的数据表明早期治疗反应模式甚至可以预测整体反应和结果。”

论文原文：

Melton, C.A.; Freese, P.; Zhou, Y.; Shenoy, A.; Bagaria, S.; Chang, C.; Kuo, C.-C.; Scott, E.; Srinivasan, S.; Cann, G.; et al. A Novel Tissue-Free Method to Estimate Tumor-Derived Cell-Free DNA Quantity Using Tumor Methylation Patterns.Cancers 2024, 16, 82. https://doi.org/10.3390/cancers16010082.

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