FSHW | 次氯酸钠诱导的可存活但不可培养（VBNC）状态肠炎沙门菌应激反应的转录组与蛋白质组综合研究

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Introduction

次氯酸钠（NaClO）因操作简便、杀菌高效、成本低廉而被广泛使用，但不当使用可能诱导细菌进入可存活但不可培养（VBNC）状态。此类细菌虽不能形成菌落，却仍保持代谢活性，在适宜条件下可复苏，威胁食品安全与公共卫生。高通量转录组与蛋白质组技术为研究细菌应激机制提供了新手段。已有研究揭示了NaClO对肠炎沙门菌的蛋白质组学应答，但对其进入VBNC状态的条件与适应机制仍缺乏系统认识。本研究旨在探讨NaClO诱导肠炎沙门菌（Salmonella Enteritidis）形成VBNC状态的条件、特征及其应激响应机制，并通过转录组与蛋白质组联合分析进行阐释。

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Results and Discussion

次氯酸钠诱导下肠炎沙门菌进入VBNC状态

如图1A所示，当肠炎沙门菌暴露在50 mg/L次氯酸钠溶液中时，可培养细胞数量迅速下降，而仍存活的细胞数量维持在106～108 cells/mL之间。经过2.5 h处理后，虽然菌落已无法培养，但仍有约61%的细胞保持活性（图1F），说明大量细胞进入了可存活但不可培养（VBNC）状态。该浓度与常规食品加工和屠宰环节的消毒水平相当，意味着在常规消毒条件下，部分沙门菌仍可能以VBNC形式存活，并在适宜条件下复苏。

图1 肠炎沙门菌在50 mg/L次氯酸钠作用下0.5～3 h的可培养与可存活细胞变化

VBNC状态肠炎沙门菌的特征变化

形态变化

扫描电镜和透射电镜结果显示，正常菌体呈规则杆状、膜结构完整；而VBNC状态的菌体体积明显变小，细胞膜出现破裂或不规则形态，甚至部分细胞发生溶解（图2A–H），表明强氧化环境导致细胞结构受损。

细胞内ROS水平

VBNC菌的活性氧（ROS）含量显著升高（图2I），说明氯消毒产生的自由基会在细胞内引发强烈的氧化应激，可能损伤DNA、膜结构和其他生物分子。

NAD⁺/NADH比例变化

如图2J所示，VBNC菌的NAD⁺/NADH比值大幅上升，提示细胞内氧化还原平衡被破坏，能量代谢受抑，处于一种“低代谢休眠”状态。

ATP含量下降

VBNC细胞的ATP水平由对照组的3.9 nmol/L降至约0.98 nmol/L（图2K），说明氯处理破坏了能量代谢过程和膜完整性，导致能量耗竭，细胞处于休眠或濒死状态。

图2 VBNC状态肠炎沙门菌的形态和生理特征变化

氯消毒下VBNC状态肠炎沙门菌的转录组与蛋白质组响应

转录组响应

为了深入了解VBNC状态肠炎沙门菌对氯胁迫的分子适应机制，研究者利用全转录组测序分析了其mRNA水平变化。结果显示，VBNC组与对照组的表达模式差异明显（图3A），共有4134个转录本发生差异，其中267个基因上调，207个下调。GO富集分析显示，这些差异基因主要涉及刺激应答、信号传导及物质转运等功能（图3B）。

与对照组相比，VBNC细胞中两组分系统、生物膜形成、ABC转运蛋白、分泌系统及鞭毛装配等相关基因显著富集（图3C），说明细胞通过激活这些通路提高环境适应性。同时，与蛋白合成和结构功能相关的基因被下调，反映出细胞降低代谢活性，以维持低能耗的存活状态。

图3 VBNC状态肠炎沙门菌的差异基因分析

蛋白质组响应

为了进一步揭示VBNC状态下的应激机制，研究者对其蛋白质组进行了分析。结果发现，共检测到21594条肽段和4464种蛋白，其中1031种显著差异表达（上调613种，下调418种）（图4A）。

功能富集结果显示，这些差异蛋白主要参与应激响应、生物调控、细胞通讯以及能量代谢等过程（图4B）。KEGG通路分析进一步表明，柠檬酸循环、HIF-1信号通路及糖酵解/糖异生等能量代谢相关途径被显著激活（图4C）。这些变化说明VBNC细胞在受到氯胁迫后，通过调节代谢与信号通路来维持基础生命活动。

图4 VBNC状态肠炎沙门菌的差异蛋白分布及富集分析

转录组与蛋白质组关联分析

基因与蛋白表达的关联分析显示，两者的表达变化并非完全对应（图5A），这与转录后及翻译后调控有关。尽管如此，二者在多个关键通路中呈现共同富集，包括代谢途径、ABC转运系统、DNA复制及生物膜形成（图5B），表明这些通路是细菌维持VBNC状态的核心环节。

图5 转录组与蛋白质组数据的整合分析

外排泵系统

VBNC状态下，多种外排泵相关基因显著上调，其中dppC、lolD、ugpE等ABC外排泵基因提高16～32倍（图6A）。蛋白质组结果显示，多药外排泵蛋白AcrA、TolC、MdtK等也明显上调，尤其是RND型外排系统AcrAB-TolC及其调控因子ramA上升2倍以上。这些变化表明，VBNC细胞通过增强外排能力，主动排出有毒物质与消毒剂成分，从而保持细胞内部稳定并延长存活时间。

氧化应激反应

VBNC细胞中，氧化应激调控相关基因显著激活。红氧敏感转录因子SoxR和还原蛋白RseC分别上调4倍与8倍（图6B），显示OxyR依赖的氧化防御系统高度活跃。同时，抗氧化蛋白如硫氧还蛋白（TrxA/B）和谷胱甘肽还原蛋白（GrxB/C）显著上调。

此外，与电子传递及氧化还原调控相关的tucA、fadA、apbE、mioC、lldD及NADH-脱氢酶复合体等基因均显著增强表达，说明细胞通过提高氧化还原活性与抗氧化能力来抵御ROS的破坏。这种应答帮助VBNC细胞在强氧化环境中维持能量代谢平衡和基本生理功能。

图6 关键基因在mRNA和蛋白水平上的表达柱状图

DNA修复

VBNC状态下，肠炎沙门菌的DNA修复系统被显著激活。SOS反应相关调控因子LexA和RecX的表达分别上升约2倍和4倍，表明SOS修复通路被启动（图6C）。LexA调控基因的普遍上调说明细胞正积极应对DNA损伤，相关的修复基因如radA、radC、recO和recN上调幅度达2–16倍。与此同时，核苷酸切除修复基因（uvrA、uvrB、uvrC、uvrD）、DNA错配修复基因（mutH、mutL、mutS、vsr）及核糖体蛋白基因（rplD、rplM、rplP、rpsP）也显著上调。

此外，与DNA损伤应答相关的GTP酶（mnmE、typA、RsgA）及DNA依赖ATP酶（RecB、YeaH等）表达升高，进一步说明修复机制处于活跃状态。蛋白质组结果也验证了DNA修复相关蛋白（如MutH、MutL、RadA、RadC）的显著富集。总体上，这表明氯消毒造成的DNA损伤超过了细胞常规修复能力，促使细菌启动SOS及突变型修复机制来维持生存。DNA复制相关蛋白如DnaA与RecF也上调，有助于细胞在受损环境中维持基因复制稳定。

毒力因子

研究发现，VBNC状态下的肠炎沙门菌仍保持甚至增强了部分致病相关功能。III型分泌系统（T3SS）及其效应蛋白显著上调，其中sopA、sopB、sspH2、sipA上调2～8倍，结构蛋白SseA与SseL上调约2倍（图6D）。T3SS作为细菌入侵宿主的重要装置，可将毒力蛋白直接注入宿主细胞，增强感染能力。

同时，VBNC细胞的鞭毛基因如fliA、fliF、flgA等显著上调4～32倍，σ28因子（fliA）表达上升约9倍，说明鞭毛生成与运动性增强。这有助于细菌在不利环境下移动、形成生物膜并寻找更适宜的生存区域。黏附相关基因shdA、fimH、sadA、misL也上调4～16倍，蛋白层面上黏附蛋白PagN与FimH上调约2倍，提示其黏附与侵袭能力增强。

更值得关注的是，代谢微结构Eut和Pdu系统显著上调8～32倍，涉及乙醇胺（Eut）与1,2-丙二醇（Pdu）的利用通路。这些细胞代谢囊泡可包裹有害中间产物，提升代谢效率，使细菌能在肠道缺氧环境中更具生存优势。相关调控基因arcA、arcB及cAMP-Crp调控因子也同步上升2～8倍，进一步增强能量代谢与适应能力。

这些变化表明，VBNC状态下的沙门菌可能仍具活跃的代谢与致病潜能，在人体肠道内可能造成更强的感染风险，对食品安全和公共卫生构成潜在威胁。

差异基因与蛋白的表达验证

为验证转录组与蛋白质组结果的可靠性，研究者随机选取了8个差异基因和8个差异蛋白进行RT-qPCR和PRM验证。结果显示，acrA、arcD、ampG、fadA、pduL、radC、soxR等基因的表达趋势与RNA-seq结果一致（图5C），蛋白质组的PRM验证结果也与原始数据相符（图5D），说明本研究的多组学分析数据具有较高可靠性。

03

Conclusion

本研究结合转录组与蛋白质组分析，系统揭示了氯消毒诱导的VBNC状态肠炎沙门菌的适应机制。结果表明，这些细胞通过多种应激途径应对氧化损伤与环境压力，包括DNA修复、SOS反应、氧化应激防御、多药外排系统（RND）以及III型分泌系统（T3SS）。同时，鞭毛和代谢囊泡（Eut与Pdu BMCs）的增强表达可能进一步提升其致病性与肠道生存能力。

研究提示，氯消毒可能无法彻底清除沙门菌VBNC细胞，这类细胞仍具潜在感染风险，亟需制定更科学、彻底的消毒策略，以降低其对食品与公共健康的威胁。

An integrated transcriptome and proteomic investigation of the stress responses of viable but non-culturable (VBNC) state Salmonella Enteritidis triggered by sodium hypochlorite

Wen Wanga,b,1, Wensi Wangb,c,1, Zhengkai Yib, Jiele Mab, Wenfu Houc, Yingping Xiaob, Hua Yangb, Hongxun Wangc,*, Xingning Xiaob,*

a Key Laboratory of Microbiological Metrology, Measurement & Bio-product Quality Security, State Administration for Market Regulation, College of Life Sciences, China Jiliang University, Hangzhou 310018, China

b State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, MOA Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products (Hangzhou), Institute of Agro-product Safety and Nutrition, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China

c College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Viable but non-culturable (VBNC) bacteria after chlorination disinfection pose a considerable threat to the public health and environment. The current work aimed to uncover the stress adaptation mechanisms of VBNC Salmonella Enteritidis to sodium hypochlorite. In this study, we investigated the morphology, gene expressions and proteomic profile in VBNC S. Enteritidis. It demonstrated that 109 cells/mL of bacteria could transition into the VBNC state after exposure to 50 mg/L chlorine for 2.5 h. The VBNC state cells exhibited cellular membrane impairment, decreased size, and intracellular ATP depletion compared to the culturable cells. In the VBNC state cells, there was a significant increase in intracellular reactive oxygen species (ROS) levels and NAD+/NADH ratios. This observation suggested an imbalance in the intracellular redox status of the VBNC bacteria. Transcriptome and proteomic analysis revealed significant upregulation of the resistance-nodulation-division (RND) efflux systems (arcA, tolC, ramA), oxidative stress response genes (soxR, trxA, grxB), DNA repair genes (lexA, radA, mutH, mutL), and virulence factor genes (sseA, sseL, eutS, and eutE). Our findings indicated that it is important to formulate disinfection protocols that are specifically designed for food processing plants and healthcare facilities, focusing on implementing a more thorough disinfection method to effectively eradicate VBNC cells.

Reference:

WANG W, WANG W S, YI Z K, et al. An integrated transcriptome and proteomic investigation of the stress responses of viable but non-culturable (VBNC) state Salmonella Enteritidis triggered by sodium hypochlorite[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250213. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250213.

翻译：王小云（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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