【Adv. Sci.】南方医科大学合作发文：乳腺癌靶向免疫反应新见解

【导读】术中放疗（intraoperative radiation therapy， IORT）引发的免疫反应的综合分析尚不完整。

11月4日，南方医科大学与中山大学以及南华大学研究人员合作共同在期刊《Advanced Science》上发表了研究论文，题为“Landscape of the Peripheral Immune Response Induced by Intraoperative Radiotherapy Combined with Surgery in Early Breast Cancer Patients”，本研究中， 研究人员对IORT前后的早期乳腺癌患者的外周血单个核细胞（PBMCs）进行单细胞RNA测序和单细胞T细胞受体测序。IORT联合手术（定义为IORT+手术）后，PBMC计数保持稳定，T细胞、单核吞噬细胞和浆细胞比例升高，中性粒细胞比例降低。术中放疗后CD8Teff_GZMK细胞的细胞毒性评分显著升高。IORT后CD8Teff_GZMK细胞与其他免疫细胞通过MIF_CD74和MIF_TNFRSF14的交流减少。治疗后T细胞克隆明显扩增。IORT+手术可部分抑制中性粒细胞的抗肿瘤作用。流式细胞术分析和共培养实验被用于更深入地研究T细胞的功能变化。IORT+手术显著增强了T细胞的细胞毒活性。阻断PD-1后，术中放疗后PBMC的T细胞活性高于术前PBMC。这项研究强调了IORT对免疫细胞的影响，为乳腺癌的靶向免疫反应提供了新的见解。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202308174

背景信息

01

筛查技术的发展提高了早期乳腺癌的检出率。保乳手术联合外放疗已成为治疗早期乳腺癌的标准方法。放疗有助于提高局部疾病管理和总生存率。乳腺癌保乳术后辅助放疗是在伤口愈合或完成化疗后进行。全乳放疗常规计划为50Gy/25次，总治疗时间为5 ~ 7周。放疗给患者带来不便，增加了经济成本。部分患者可能因术后并发症导致放疗延迟。术中放疗（Intraoperative radiotherapy， IORT）是在外科手术过程中实施的高剂量照射。IORT避免了术后组织瓣移位导致的瘤床定位偏差，提高了瘤床推放的准确性。术中放疗可有效管理瘤床，而瘤床是肿瘤复发风险较高的区域。它还降低了因化疗而导致的放疗延迟而导致的肿瘤增殖风险。IORT与全乳放疗在生存和不良反应方面有相似的结果，但完成治疗所需的时间更短。在这种情况下，IORT是早期乳腺癌保乳手术患者的良好选择。

肿瘤微环境（tumor microenvironment， TME）受多种因素的影响。遗传改变、表观遗传修饰以及不同细胞类型之间的相互作用导致了TME调控的复杂性。此外，放疗可以改变细胞表型和组织成分，从而影响癌细胞生存和肿瘤微环境。辐射不仅影响靶细胞，也影响未受辐射的邻近细胞，这种现象被称为辐射诱导的旁效应。在一些已发表的研究中，IORT已被证明影响肿瘤细胞和伤口渗出液。单次高剂量IORT通过触发免疫系统诱导癌细胞的免疫原性细胞死亡。研究人员进行了流式细胞术检查，观察到IORT后3周，NK CD56+高CD16+亚群显著上升。然而，关于IORT触发的外周免疫反应的信息仍然未知。

IORT抑制了中性粒细胞的功能

02

研究人员通过单细胞RNA测序识别出三种中性粒细胞群：中性粒细胞_IFIT1细胞、中性粒细胞_DUSP6细胞和中性粒细胞_S100A1细胞。在图1B中展示了中性粒细胞群在IORT+手术前后差异表达基因的热图。中性粒细胞_IFIT1细胞表达ISG15、MX1和IFIT1；中性粒细胞_DUSP6细胞表达PI3、CCR3和SIGLEC10；中性粒细胞_S100A12细胞表达S100A12、MMP9和RFLNB。图1C展示了每个样本中中性粒细胞_IFIT1细胞、中性粒细胞_DUSP6细胞和中性粒细胞_S100A12细胞的一般分布直方图。IORT+手术后，总中性粒细胞数减少，中性粒细胞_IFIT1细胞和中性粒细胞_DUSP6细胞均显示出减少的趋势。然后，研究人员进一步评估了每个中性粒细胞群在IORT+手术前后的功能变化。IORT+手术后，所有中性粒细胞群的趋化性、中性粒细胞激活和吞噬能力评分显著降低。IORT+手术对中性粒细胞衰老评分没有显著影响。根据KEGG分析，IORT+手术后的Neutrophils_IFIT1细胞在与NOD样受体信号通路、坏死性凋亡、抗原加工与呈递以及NF-κB信号通路相关的基因上显示出特定的富集。IORT+手术后的Neutrophils_DUSP6细胞在与趋化因子信号通路、细胞因子-受体相互作用、NF-κB信号通路、白细胞跨内皮迁移、催产素信号通路、IL-17信号通路、坏死性凋亡、Th17细胞分化以及NOD样受体信号通路相关的基因上显示出特别的富集。经IORT+手术处理后的中性粒细胞_S100A12细胞在与癌症相关的IL-17信号通路、中性粒细胞外泌体形成、NOD样受体信号通路、血小板激活、PD-L1表达和PD-1检查点通路、细胞凋亡、趋化因子信号通路、Th17细胞分化、HIF-1信号通路和TNF信号通路等方面显示出特定的富集。

图1：中性粒细胞的特性

IORT增强CD8+T细胞活性并与PD-1阻断产生协同作用

03

研究人员收集了六名乳腺癌患者在IORT+手术前后的PBMCs，用于后续实验。研究人员通过流式细胞术分析了PBMCs中CD8+ T细胞中GZMK+细胞的频率和CD8+ T细胞中IFN-γ+细胞的频率。结果显示，IORT+手术后CD8+ T细胞中GZMK+细胞和IFN-γ+细胞的比例显著增加（GZMK+ P <0.0001; IFN-γ+ P = 0.0012）。这些发现表明，IORT+手术后CD8+ T细胞的细胞毒性增强。PD-1是一种协同抑制分子，在T细胞功能中起着关键作用。阻断PD-1可恢复T细胞功能并促进有效的抗肿瘤反应。将激活的T细胞与MDA-MB-231或MCF-7细胞以E:T比例为3:1共培养48小时，不加或加入10微克/毫升的帕博利珠单抗（PD-1抑制剂），然后用结晶紫染色。研究人员发现，IORT+手术增强了人T细胞介导的细胞毒性。此外，在IORT+手术后用帕博利珠单抗培养的PBMCs表现出比在IORT前收集的PBMCs更强的人T细胞介导的细胞毒性。这些发现表明，当阻断PD-1时，接受IORT+手术治疗的外周T细胞会协同激活。

研究意义

04

这项研究描述了术中放疗+手术引起的系统性免疫反应，为识别增强免疫反应的潜在靶点铺平了道路。

【参考资料】

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202308174

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