《Biomater Res》上海市第六人民医院：纳米复合水凝胶助攻牵张成骨术！

牵张成骨（DO）是一种利用张力-应力效应修复大面积骨缺损的生物学技术，已全面应用于创伤性骨缺损、骨髓炎、骨肿瘤和畸形的治疗。在此过程中，骨膜介导的机械刺激起着关键作用。然而，因高能量创伤或复杂外科手术造成的骨膜缺损往往会导致骨再生不良，进一步延误牵张成骨的治疗时间。近年来，研究者们致力于设计仿生骨膜，以促进骨再生。

为此，上海市第六人民医院研究团队开发出一种纳米复合水凝胶，具有促骨生成和促血管生成的协同作用。作为一种大有前景的仿生骨膜，这种新型水凝胶有望应用在牵张成骨术等多个医疗环境中。这项研究成果发表在《Biomaterials Research》杂志上。

文献封面截图[1]

研究材料与方法

研究人员以PEGS聚合物和γ-PGA等为材料合成了一种纳米复合水凝胶（PEGS/ICPN）。在制备出这种可注射的双交联水凝胶后，测试了它的可拉伸性和骨粘附能力。在体外实验中，研究人员在大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）上测试了PEGS/ICPN水凝胶是否具有促骨生成和促血管生成的能力（其中大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化试剂盒由赛业OriCell®提供）。之后，又在大鼠牵张成骨模型上开展了体内实验。

技术路线

制备和表征纳米复合水凝胶（PEGS/ICPN）

评估PEGS/ICPN水凝胶的可注射性、可拉伸性和骨粘附能力

在体外实验中评估PEGS/ICPN水凝胶的促骨生成和促血管生成能力

在体内实验中评估PEGS/ICPN水凝胶的促骨生成和促血管生成能力

研究结果

01

纳米复合水凝胶的制备和表征

研究人员以PEGS聚合物网络和原位形成的CaP纳米颗粒（ICPN）为基础，开发出一种新型水凝胶。PEGS是一种具有生物相容性的线性聚酯，带有可官能化羟基，通过氨基改性形成有机基质。PEGS-NH2和γ-PGA（γ-聚谷氨酸）溶于超纯水中形成均质的聚合物前体。带有大量羧基的γ-PGA作为成核位点，通过-COO--Ca2+离子配位诱导CaP纳米颗粒原位沉淀，形成物理交联结构。之后，在EDC/NHS的作用下，PEGS-NH2和γ-PGA通过偶联反应形成化学交联结构（图1）。

图1. 制备双交联纳米复合粘性水凝胶的示意图[1]

接下来，研究人员评估了这种纳米复合水凝胶的可注射性、可拉伸性和骨粘附能力。他们发现，水凝胶前体在偶联剂存在下可以形成水凝胶，而且合适的成胶时间赋予其理想的可注射性和可操作性，适合牵张成骨手术的临床操作。同时，与PEGS水凝胶相比，PEGS/ICPN水凝胶具有更好的拉伸性，表明带有ICPN的水凝胶能够承受更大的外力和变形。此外，与商业化纤维蛋白胶相比，这种实验水凝胶与骨的粘附性强，拉伸5mm以上未出现界面分离和大块断裂，表明它能满足动物实验的基本力学性能要求。

02

纳米复合水凝胶的体外促骨生成和促血管生成作用

研究人员在不同水凝胶上培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC），以评估PEGS/ICPN水凝胶的各种性能。与对照组和PEGS组相比，PEGS/ICPN水凝胶上的BMSC细胞存活率更高，且培养出的BMSC呈现出更多的延展和拉伸形态，表明这种水凝胶的多孔表面和机械性能有利于细胞粘附。在对比了不同含量的CaP纳米颗粒后，他们发现含有20% CaP纳米颗粒的纳米复合水凝胶（PEGS/20ICPN）为细胞的存活、粘附和增殖提供了最有利的条件。

碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色结果显示，PEGS/ICPN组更好地促进了骨生成，尤其是PEGS/20ICPN组。免疫荧光染色和PCR结果也显示，PEGS/ICPN组的成骨相关基因（Runx2、OPN、OCN等）表达量明显高于其他组（图2），表明CaP纳米颗粒的引入可创造更有利的成骨环境。同时，他们还利用transwell系统研究了PEGS/ICPN水凝胶对BMSC与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）之间相互作用的影响。将HUVEC与BMSC共同孵育后，PEGS/20ICPN组的毛细血管样结构明显比其他组更长。这些结果表明，PEGS/ICPN支架介导的BMSC通过促进BMSC与HUVEC之间的相互作用，激发了HUVEC的血管生成反应。

图2. PEGS/ICPN水凝胶的体外促骨生成作用[1]

03

纳米复合水凝胶的体内促骨生成和促血管生成作用

之后，研究人员在大鼠胫骨牵张成骨模型上测试了纳米复合水凝胶的性能，根据体外实验的结果，他们选择了PEGS/20ICPN水凝胶进行后续分析。在固位四周后，3D重建图像显示，对照组再生处的中间有明显的缺损间隙，而PEGS/20ICPN组有大量新骨形成。PEGS组和PEGS/20ICPN组的BMD和BV/TV值明显高于对照组，其中PEGS/20ICPN组在体内表现出最理想的促骨生成能力（图3）。此外，与其他两组相比，PEGS/20ICPN组在四周时观察到更多的成熟骨小梁和更少的软骨或纤维样组织。

在牵张成骨的过程中，支架诱导的新血管生成可提供足够的营养来促进骨重建。内皮细胞标志物CD31的免疫荧光染色结果显示，PEGS/20ICPN组生成的新生血管明显更多。对于血管生成的重要调控因子HIF-1α，他们发现PEGS/20ICPN组的HIF-1α染色最深，与体外研究结果一致。这些结果表明，PEGS/20ICPN水凝胶除了直接促进骨生成外，还能协同促进血管生成和骨生成，这是它在牵张成骨过程中促进骨形成的另一重要机制。

图3. PEGS/20ICPN水凝胶改善了骨再生和血管化[1]

结论

图4. PEGS/ICPN水凝胶的设计策略及其在牵张成骨中的应用[1]

受骨膜功能启发，这项研究开发出一种纳米复合水凝胶（PEGS/ICPN），作为一种强大的生物材料骨膜替代物，它可加速牵张成骨手术。这种仿生骨膜在体外和体内均被证明具有促骨生成和促血管生成的协同作用。总的来说，这种水凝胶具有很大的临床转化潜力，可应用于牵张成骨及其他医疗环境，比如骨折愈合和牙周组织再生。

原文检索

[1] Lou, T., Chen, K., Luo, Q. et al. Periosteum-inspired in situ CaP generated nanocomposite hydrogels with strong bone adhesion and superior stretchability for accelerated distraction osteogenesis. Biomater Res 26, 91 (2022). https://doi.org/10.1186/s40824-022-00330-1