牛肉低温贮藏环境中沙门氏菌诱导耐酸响应的存在程度及其产生机制

沙门氏菌（Salmonella）能够引起腹痛、腹泻、肠胃炎和发烧等疾病，是世界范围内造成人类感染和经济损失的重要食源性致病菌。在我国，动物性食品的消费是引发沙门氏菌病的首要原因。诱导耐酸响应（ATR）是指细菌在微酸条件下生存一段时间后（即诱导过程），对普遍致死的强酸性环境（即酸激介质）的抵抗能力增强的现象，又称作酸耐受应答反应。ATR一旦形成，不仅能提高细菌对酸的抵抗，还能增强菌株毒力基因的表达，增强细菌耐热、耐盐、耐氧化等能力，使细菌轻易越过食品加工过程中的各类栅栏因子，危害终端食品的安全。针对肉类生产，冷鲜牛肉的生产及成熟过程具有诱发沙门氏菌ATR的可能，这些诱导因素包括酸性消毒减菌剂的广泛应用在工厂内部形成的弱酸环境、宰后胴体pH值的降低、高蛋白的营养成分等。然而目前沙门氏菌ATR被引发后，其在肉牛的屠宰过程及牛肉贮藏过程中的消长规律仍不明确，并且，外界的弱酸性环境诱发细菌的ATR相关反应机理仍需进一步探索。

因此，山东农业大学食品科学与工程学院的郎晨晓、张一敏、罗欣*和董鹏程*等人模拟沙门氏菌在牛肉生产、贮藏过程中经历的弱酸、低温、高蛋白的环境，辅以λRed基因敲除技术，探究微酸诱导、低温长期贮藏、双组分调控对沙门氏菌ATR的影响，以明确ATR在牛肉加工与贮藏过程中的存在程度与消长规律。并通过实时聚合酶链式反应（real-time PCR）、氨基酸添加实验等技术建立双组分系统与氨基酸代谢的联系，提出并验证沙门氏菌的双组分系统PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB能够感应细胞外H + 浓度，并调控氨基酸代谢系统以获得更高的耐酸性这一理论假设，旨在进一步解释细菌诱导ATR产生的内在机理。

1 微酸诱导、双组分基因敲除及长时间低温贮藏对沙门氏菌耐酸性的影响

结果显示经过不同诱导处理的PhoP/PhoQ正常菌（14028）和缺失菌（ΔphoP）在不同贮藏时间点的耐酸情况，菌落下降数越大细菌的耐酸能力越弱。双组分系统、微酸诱导处理、低温贮藏时间三因素的交互作用对耐酸能力影响不显著（P＞0.05）。双组分系统和微酸诱导处理、微酸诱导处理和低温贮藏时间的交互作用对耐酸能力有显著影响（P＜0.05）。

图1为沙门氏菌ATR的产生以及在低温贮藏过程中的消长变化，及贮藏前微酸诱导处理和低温贮藏时间的交互作用对沙门氏菌耐酸性的影响。经过TSBG微酸诱导菌株的耐酸能力显著高于对照组（P＜0.05），说明沙门氏菌分解其中葡萄糖形成的微酸环境能够激发细菌的ATR。诱导菌株在第7天的耐酸性仍显著高于未诱导组（P＜0.05），这说明，沙门氏菌的ATR一旦产生，在低温环境中至少可以维持7 d，该结果表明，致病菌的ATR可能会贯穿牛肉的整个分割、运输和贮藏过程，并且其产生的耐酸、耐渗透压、耐盐等交叉保护作用可能随原料一直进入下游产品（如发酵肉制品），突破栅栏因子，对食品安全造成极大的危害，但目前这种现象在牛肉产业的存在却很少受到重视。

相对于微酸诱导组，对照组菌株在7 d低温贮藏过程中的耐酸能力无显著变化（P＞0.05），说明虽然在长期贮藏过程中沙门氏菌一直处于微酸的肉汤培养基中（pH值为5.2～5.7），但该低温环境并未引发对照组菌株耐酸性的增强。与之形成对比的是，诱导菌株在第7天的耐酸能力显著高于第1天（P＜0.05）。

为研究双组分系统PhoP/PhoQ对菌株诱导耐酸能力的贡献，分析微酸诱导处理和敲除双组分基因的交互作用对耐酸性的影响，如图2所示。结果显示，PhoP/PhoQ对耐酸性的提升与细菌贮藏前微酸诱导处理有显著交互影响（P＜0.05）。phoP基因的敲除能够显著降低微酸诱导处理组沙门氏菌的耐酸能力（P＜0.05），但对对照组的影响并不显著（P＞0.05）。该结果表明微酸诱导处理和双组分系统能够协同提升沙门氏菌的耐酸能力，是沙门氏菌ATR系统的两个重要组成成分，并证实了微酸环境中的H+通过PhoP/PhoQ启动沙门氏菌内部的耐酸机制，本实验中PhoP/PhoQ调控ATR的过程是否受金属离子影响仍待研究。

当phoP缺失后，经过诱导的沙门氏菌的耐酸能力虽然降低，但仍显著高于未经诱导的菌株（P＜0.05），这说明在诱导菌株抵抗酸性胁迫的过程中，除PhoP/PhoQ，还有其他耐酸机制的保护作用，如其他双组分信号感应体系、细胞膜系统和质子外排系统等。已有研究表明，细菌的PmrA/PmrB、OmpR/EnvZ等双组分系统也能够对外界的酸性信号作出响应。

2 TCS缺失对精氨酸和赖氨酸代谢相关酶基因表达量的影响

为研究PmrA/PmrB是否与PhoP/PhoQ相同，也能调控沙门氏菌ATR，并且该过程是否是通过精氨酸和赖氨酸两种脱羧代谢途径实现，本研究对比了PmrA/PmrB和PhoP/PhoQ缺失前后，沙门氏菌的两种脱羧酶编码基因（adiA和cadA）的表达水平。

图3结果显示，沙门氏菌的phoP和pmrA缺失后，精氨酸脱羧酶编码基因adiA相对表达量显著降低（P＜0.05）。该结果表明，除PhoP/PhoQ，PmrA/PmrB也能被环境中的H+信号激活，进而对ATR产生调控，精氨酸脱羧系统是它们的正向调控靶系统。

图4结果显示，与adiA结果类似，ΔphoP和ΔpmrA的赖氨酸脱羧酶编码基因cadA相对表达量也显著低于正常菌（P＜0.05）。说明除精氨酸脱羧通路外，赖氨酸脱羧系统也能够受到PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB的正向调控。值得注意的是，沙门氏菌的PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB在应激调控过程中可能存在协同作用。但本实验中的两种氨基酸代谢的调控过程中，PmrA/PmrB与PhoP/PhoQ是否存在联系，仍需进一步研究与验证。

3 酸激介质中添加精氨酸和氨基酸对菌株ATR的影响

为从表观现象验证PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB能够通过精氨酸代谢和赖氨酸代谢进一步调控沙门氏菌的诱导耐酸现象，通过在酸激介质中添加精氨酸和赖氨酸，对比PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB正常与缺陷菌株的耐酸能力，结果显示双组分系统、氨基酸添加的交互作用能显著影响沙门氏菌的耐酸性（P＜0.05）。

对于同一菌株，在作为酸激介质的纯矿物质培养基MM中添加精氨酸和赖氨酸后，3 种双组分系统处理（正常菌、ΔphoP、ΔpmrA）的耐酸性均显著升高（P＜0.05），该结果说明精氨酸和赖氨酸代谢都是沙门氏菌提高自身耐酸性的重要途径，同时，在MM中双组分系统突变菌的耐酸性显著低于正常菌（P＜0.05），说明除氨基酸代谢外，PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB可能还调动了其他的耐酸机制帮助细菌应对酸性胁迫。此外，MM+Arg组和MM+Lys组的耐酸能力差异不显著（P＞0.05），即不同的氨基酸种类对耐酸性的提高并无显著影响。

虽然MM+Arg和MM+Lys组中添加了精氨酸和赖氨酸，但phoP或pmrA基因敲除后菌株的耐酸性仍显著低于正常组（P＜0.05），说明氨基酸虽然有助于细菌提高酸耐受能力，但并不能改变TCS缺失导致的耐酸缺陷，该结果从表观水平上验证了前述real-time PCR的结论，即PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB能够通过控制氨基酸代谢增强沙门氏菌的耐酸能力。

结 论

本研究表明微酸诱导过程能显著增强沙门氏菌的耐酸能力（P＜0.05），并且菌株的ATR一旦形成，在牛肉低温贮藏（4 ℃）过程中可以维持至少7 d，其产生的交叉保护作用可能会严重威胁以牛肉为原料的下游产品的安全性。随着贮藏保鲜技术的发展，冷鲜牛肉的货架期也逐步延长，沙门氏菌耐酸性的存续时间与不同包装、贮藏方式下货架期的关系仍待进一步确定。微酸性肉质介质（pH 5.2～5.7）的低温贮藏环境不能引发沙门氏菌的耐酸反应，说明低温处理可以作为抑制沙门氏菌诱导ATR的方法。基因敲除和氨基酸添加实验揭示了沙门氏菌的双组分系统PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB均参与了外界酸性环境的感知，并可以通过调节精氨酸和赖氨酸的代谢水平提高细菌的耐酸性，因食品中丰富的氨基酸含量，该推论进一步解释了食品基质在强酸环境下能为沙门氏菌提供保护的内在机理。除PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB外，是否有其他组分系统参与沙门氏菌ATR的调控，以及这些系统能否通过酸休克蛋白和氨基酸代谢外的其他机制影响ATR仍待研究。

本文《牛肉低温贮藏环境中沙门氏菌诱导耐酸响应的存在程度及其产生机制》来源于《食品科学》2021年42卷6期68-74页，作者：郎晨晓，张一敏，朱立贤，梁荣蓉，毛衍伟，杨啸吟，韩广星，罗欣，董鹏程。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191128-287。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

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