体内脊髓钙成像

图1： 在传递外周刺激期间清醒、行为动物的脊髓钙成像。脊髓投射神经元活动(Phox2a-Cre;Ai162(GCaMP6s))与刺激应用对齐(底部有红色垂直线)。视野为2169 x 3036 μm。Kinetix sCMOS相机采集的图像。

背景

Biafra Ahanonu 博士是加州大学旧金山分校 Alan Basbaum 教授实验室的博士后学者和 HHMI Hanna H. Gray 研究员，他的研究主要集中在疼痛的神经和分子机制上。Ahanonu 博士描述了他的工作：“我们正试图了解神经系统如何响应急性和慢性疼痛而变化。如果我们能够确定哪些神经元发生变化，我们就有可能调节这些神经元以减轻疼痛。

“我们研究大脑和脊髓，并使用荧光钙成像来推断清醒、行为动物模型中不同神经元和神经胶质细胞群的状态。我们在基线成像期间观察自发的神经活动，然后我们通过用 von Frey(僵硬的鬃毛)毛发或其他刺激(例如那些产生热或冷感觉的刺激)来研究诱发的神经活动。此外，虽然刺激可以是相同的，但对该刺激的感知可能会随着时间的推移或慢性疼痛而改变。我们想回答：这种变化发生在神经系统的哪个地方?

图2： 在传递外周刺激期间清醒、行为动物的脊髓钙成像。脊髓投射神经元活动(Phox2a-Cre;Ai162 (GCaMP6s))与身体单侧的刺激应用(红色条)对齐。比例尺，300 μm;视场角为 2169 x 3036 μm。Kinetix sCMOS相机采集的图像。

图 3：使用 Kinetix sCMOS 相机对轴突和神经活动进行脊髓成像。A)在对Thy1-GFP小鼠进行成像的第158天，左右脊髓的多个节段的图像显示GFP +轴突。B)使用TwinCam和两个Kinetix相机作为动物机车(帧#1)或对红色(jRGECO1a和jRGCaMP1a)和绿色(GCaMP6s)Ca2+指示剂的冷刺激(帧#2)做出反应。C)定量来自多个区域(洋红色)或细胞(绿色)的钙瞬变，因为动物对感觉刺激(垂直线)或运动(蓝色迹线，连接到旋转编码器的运行轮)做出反应。D) Phox2a-Cre 中脊髓投射神经元 (SCPN) 活动(绿色)和始终可见的 SCPN 标记(洋红色)的同时成像;Ai162(GCaMP6s，绿色);Ai9(tdTomato，洋红色)小鼠。白色箭头，活跃的 tdTomato+ 细胞。E)定量来自编号为D的细胞的钙瞬变，以响应施加到后爪的各种外周刺激。F) 与另一种动物的 D 相同。比例尺：200 μm。解剖轴缩写：C，尾部;左，左;R，右;Ro，喙部。使用 CELLMax (https://doi.org/10.25740/vh359hb5216) 或 ROI 分析用 CIAtah (github.com/bahanonu/ciatah) 提取神经活动。

挑战

Ahanonu 博士解释了他的成像挑战，“出于多种原因，我们需要快速、灵敏的采集，例如与大多数脑成像相比，对快速钙瞬变进行成像、减少光毒性和漂白以及处理脊髓的独特运动。在成像过程中，脊髓可以在一秒钟内非常快速地移动数百微米，因此需要非常短的曝光时间以避免图像模糊，并在分析过程中更容易进行运动校正。因此，虽然我们可以以 20 赫兹的速度获取图像，但我们需要 1-10 毫秒之间的曝光时间。由于这些低曝光时间使得检测较弱的、生物学相关的信号变得更加困难，因此读取噪声和量子效率变得至关重要。我们旧相机的读取噪声较高，量子效率较低，因此很难在不进行平均或其他妥协的情况下检测信号，例如在尝试提高信噪比时使用更高的激发功率造成的光损伤，因此我们需要更灵敏的相机。

“有时，仅在身体的一侧受伤，而疼痛感会扩散到身体的其他部位。因此，我们需要一个大视野来捕捉脊髓的两侧。然后我们可以解决：如果我们在身体的左侧给予刺激，它对脊髓的两侧有何影响?更大的视野还可以帮助我们对通过刺激不同身体部位被激活的脊髓的多个部分进行成像，因此这是一个关键特征。

Ahanonu 博士需要一种具有高速采集、高灵敏度、低读取噪声且具有大视场的探测器。

Kinetix 在高信噪比成像方面发挥了重要作用，以检测更弱的细胞，并且多种成像模式非常有用。------Biafra Ahanonu博士

解决方案

Kinetix sCMOS 是该应用的理想成像解决方案，Ahanonu 博士为该项目使用了多个，“我们在同一系统上测试了来自多家公司的多台不同相机，以进行公平的比较，并选择了 Kinetix。Kinetix 总体上非常出色，在大视场和多种成像模式方面，这非常有用。我主要使用灵敏度或动态范围模式，具体取决于荧光指示剂的强度。我还在某些情况下使用了速度模式，例如，当观察脉管系统并希望以 500 到 900 Hz 的频率进行采集时。

“这是一次积极的经历;我们经常使用 Kinetix 系统，因为它具有高量子效率和低读取噪声的额外优势。Kinetix 在这个项目中发挥了重要作用，使我们能够将曝光率降低到足够低以进行运动校正，同时仍然获得足够高的信号来检测低信噪比单元。

“两台Kinetix相机使用TwinCam集成到3i VIVO多光子显微镜中。我们使用一个 Kinetix 作为红色通道，一个用于绿色通道，这样我们就可以在大视野中同时进行多色成像。这是在 3i 的 SlideBook 成像软件中运行的，但我们也使用 Photometrics 软件进行同步录制。我们发送 TTL 触发器来同步 Kinetix 摄像机。

“电压成像是我们感兴趣的东西，我们可以将 Kinetix 与全息激励结合使用，在未来进行快速、高信噪比电压成像。”