《食品科学》：光明乳业股份有限公司杨婷研究员：柠檬明串珠菌BD1707果聚糖蔗糖酶功能分化及酶学特性

果聚糖是由

-(2,6)-糖苷键主链和少量

-(2,1)-支链构成的天然多糖，其生物相容性、可降解性及多功能特性使其在食品、医药和生物材料领域备受关注。

果聚糖的合成依赖于果聚糖蔗糖酶（EC 2.4.1.10），其具有水解和转果糖基活性，该酶以蔗糖为底物通过non-Leloir机制催化蔗糖生成

-(2,6)-果聚糖。柠檬明串珠菌（

Leuconostoc citreum

）作为革兰氏阳性厌氧菌，是一种安全的食品级微生物，其代谢多样性（如右旋糖苷与交替糖合成能力）为功能多糖开发提供了优质资源。尽管菌株

L. citreum

BD1707已被证实具备果聚糖合成能力，但其合成路径中关键酶尚未明确。基于基因组挖掘在柠檬明串珠菌BD1707中鉴定出2 个果聚糖蔗糖酶编码基因（Lc-SacB1和Lc-SacB2）后，本研究旨在解析双基因的催化功能分化机制及挖掘新型酶资源。

光明乳业股份有限公司光明乳业研究院的杨婷通过采用异源表达技术验证双酶活性差异，结合生物信息学分析（三维结构建模及关键功能域对比）、酶学性质表征（最适条件、金属离子效应、动力学参数）及产物结构解析（核磁共振、分子质量测定）系统探究双酶的催化特性与结构基础，并探讨双基因功能分化的潜在机制，旨在为新型酶资源的开发与分子改造奠定理论基础。

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果聚糖蔗糖酶基因挖掘与保守结构域解析

基于基因组测序分析，

L. citreum

BD1707基因组中鉴定出2 个连续排列的GH68成员基因（ORF1291与ORF1292），分别编码1 188 个和1 215 个氨基酸残基（图1A）。结构域预测结果表明，Lc-SacB1与Lc-SacB2均包含N端信号肽、糖苷水解酶催化结构域及7 个SH3_8折叠结构域。

进一步通过多序列比对发现，尽管不同来源果聚糖蔗糖酶存在显著种属差异，但其核心催化域呈现高度保守性。以首个解析晶体结构的

B. subtilis

来源果聚糖蔗糖酶（PDB∶1OYG）为参考（图1B），Lc-SacB1/Lc-SacB2在以下关键功能域中完全保守：1）催化三联体Asp86-Glu342-Asp247（红色星号），直接参与质子转移与糖苷键断裂；2）RDP基序Arg246-Asp247-Pro248（蓝色虚框），负责底物特异性识别；3）DEIER基序Asp340-Glu341-Ile342-Glu343-Arg344（蓝色虚框），调控果糖链延伸过程。上述保守特征从分子层面证实双酶具备典型果聚糖蔗糖酶的催化功能。

通过EMBL-EBI数据库进行同源性分析，结果显示Lc-SacB1与Lc-SacB2的氨基酸序列同源性为79%，与

Fructilactobacillus sanfranciscensis

来源果聚糖蔗糖酶的最高同源性分别为43.92%和41.75%，表明二者在GH68中具有独特进化地位。通过系统发育树分析，进一步揭示Lc-SacB1/Lc-SacB2与

F. sanfranciscensis

来源果聚糖蔗糖酶具有更密切的进化关系（图1C）。

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重组酶的异源表达

为验证Lc-SacB1与Lc-SacB2的催化功能，本研究构建了含目标基因的重组表达质粒（图2A），并将其转化至

E. coli

BL21（DE3）中进行诱导表达。经IPTG诱导后，细胞裂解液经初步活性检测显示显著的蔗糖降解活性。进一步通过Ni2＋亲和层析柱纯化获得高纯度重组蛋白，结果如图2B所示。Lc-SacB1与Lc-SacB2在约130 kDa处均呈现单一且清晰的蛋白条带，与ExPASy数据库预测值（Lc-SacB1：126 kDa；Lc-SacB2：130 kDa）高度吻合，证实二者在大肠杆菌系统中成功表达且在纯化过程中未引入杂蛋白。值得注意的是，Lc-SacB2的分子质量（130 kDa）显著高于已报道的多数同源酶：如

B. licheniformis RN-01

（56 kDa）、

Bacillus sp. TH4-2

（56 kDa）、

Clostridium acetobutylicum

（56 kDa）及

Halomonas smyrnensis AAD6T

（47.3 kDa）来源酶，而

L. mesenteroides

NTM048来源酶（113 kDa）的分子质量亦低于Lc-SacB2。上述结果表明，Lc-SacB2是迄今已知分子质量最大的果聚糖蔗糖酶，其独特的结构特征可能与其扩展的功能域（如SH3_8结构重复单元）相关。

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酶学性质分析

温度是调控酶空间构象及催化效能的关键环境因子。为探究重组酶的温敏特性，本实验评估了Lc-SacB1与Lc-SacB2在4～50 ℃范围内的活性变化。如图3A所示，二者活性变化趋势高度一致，随温度升高相对酶活力逐渐增强，30 ℃时达到峰值；当温度超过35 ℃后，酶活性被显著抑制，40 ℃时Lc-SacB2和Lc-SacB1的相对酶活力分别仅为21.3%和18.9%。对比研究表明，不同来源果聚糖蔗糖酶的最适温度存在显著种属差异，如

H. smyrnensis

AAD6T来源酶的最适温度低至15 ℃。

由图3B可知，Lc-SacB1与Lc-SacB2的最适pH值分别为6.0和5.5，且二者在宽泛pH值范围内（Lc-SacB1：5.5～7.0；Lc-SacB2：5.0～6.0）仍能维持大于80%的相对酶活力，表现出良好的环境适应性。当pH≥8.0时，Lc-SacB1与Lc-SacB2活性急剧丧失。此特性与多数已报道果聚糖蔗糖酶的最适pH值相符，如

B. halotolerans

来源酶的最适pH值为5.5～6.0，

L. mesenteroides

MTCC10508来源酶的最适pH值为5.5。上述结果表明，Lc-SacB1与Lc-SacB2的pH值适应性与其来源菌株

L. citreum

BD1707的天然发酵环境（通常为pH 5.0～6.5）存在显著生态关联性。

在体系最适温度和最适pH值条件下，分析了10 mmol/L不同金属离子对2 种重组酶活性的影响。如图3C所示，Ca2＋对Lc-SacB1与Lc-SacB2活性具有明显的促进作用，其相对酶活力分别提升了155%和134%。与之相反，Zn2＋与Cu2＋均表现出明显的抑制作用，其中Cu2＋的抑制作用最为显著，导致酶活性几乎完全失活。结果表明，这2 种重组酶对上述金属离子具有较高敏感性。EDTA作为金属离子螯合剂，使Lc-SacB1和Lc-SacB2的相对酶活力均显著下降，这与Ca2＋等金属离子激活组形成对比，表明这2 种酶的催化功能可能依赖金属离子。

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动力学参数

本研究进一步测定了2 种重组酶在不同浓度蔗糖溶液中的反应动力学参数，结果如表1所示。通过Lineweaver-Burk双倒数法计算得出，重组Lc-SacB1与Lc-SacB2对蔗糖的

K

m

分别为（9.8±0.5）mmol/L和（81.1±7.1）mmol/L，表明Lc-SacB1对底物具有显著更高的结合亲和力。Lc-SacB1、Lc-SacB2与不同来源果聚糖蔗糖酶的

K

m

相比差异显著，例如运动发酵单胞菌（

Zymomonas mobilis

）与

H. smyrnensis

AAD6T的

K

m

分别为160 mmol/L和104.79 mmol/L，这表明本实验获得的2 种重组酶对蔗糖的底物亲和力具有相对优势。Lc-SacB1与Lc-SacB2的催化常数（

K

cat

）分别为（0.28±0.01） s -1 和（3.90±0.70） s -1 ，表明后者具备更强的单位时间催化能力。由表1可知，Lc-SacB2的综合催化效率（ Kcat / Km ＝0.048 L/（s·mmol））略优于Lc-SacB1（0.029 L/（s·mmol））。基于上述动力学特征表明Lc-SacB2具有高催化速率优势，使其在工业化生物转化过程中（如规模化糖基化合物制备）具有显著应用潜力。

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重组酶转果糖基活性验证与产物特性分析

如表2所示，重组Lc-SacB2在催化蔗糖1 h后，体系中葡萄糖与果糖质量浓度分别为242.9 μg/mL和129.7 μg/mL；反应24 h时，二者分别增至581.5 μg/mL和272.4 μg/mL，不同反应时间下葡萄糖生成量均显著高于果糖。结合24 h蔗糖消耗率（97.89%），表明Lc-SacB2的活性高，能够将蔗糖主要转化为果聚糖及葡萄糖。相较之下，Lc-SacB1催化体系在1 h与24 h的葡萄糖和果糖含量均无显著差异，结果表明其仅保留水解活性，缺乏果聚糖合成能力。为进一步验证酶功能分化特性，本研究采用蛋白胶原位活性检测法进行分析。仅Lc-SacB2在130 kDa处呈现特征性白色条带（图4A），且反应产物呈高黏度凝胶状（图4B），而Lc-SacB1组未见果聚糖生成。上述结果从催化动力学与产物形态双重角度证实，Lc-SacB2为功能性果聚糖蔗糖酶，而Lc-SacB1仅有水解活性。

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果聚糖结构解析

通过NMR（1H NMR和13C NMR）解析产物化学结构（表3）。13C NMR中，异头碳区（δ 95～110）δ 104.2处特征峰归属为β-呋喃果糖C2信号；环碳区（δ 50～85）δ 59.9、δ 76.3、δ 75.2、δ 80.3及δ 63.4处的信号分别对应果糖残基C1、C3、C4、C5和C6，其中C6化学位移（δ 63.4）明确指示β-(2,6)-糖苷键的存在。1H NMR分析显示，果糖环质子信号（δ 3.4～4.2）包含7 个特征峰：H3（δ 4.20）、H4（δ 4.11）、H5（δ 3.97）、H6a（δ 3.90）、H1a（δ 3.77）、H1b（δ 3.68）及H6b（δ 3.57），各峰积分面积比为1∶1∶1∶1∶1∶1∶1，证实产物为均一β-(2,6)-果聚糖。上述结果与已报道果聚糖蔗糖酶合成产物的波谱特征高度一致，从分子层面确证了Lc-SacB2的催化特异性。进一步测定果聚糖分子质量，结果显示重组Lc-SacB2催化合成的果聚糖分子质量为4.0×106 Da（图5），为高分子质量果聚糖。

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因果聚糖具有益生元、生物功能特性相关的健康优势，使越来越多的研究人员专注于开发使用高度生物催化酶的高效生产方法。本研究首次在厌氧菌L. citreum BD1707中揭示了果聚糖蔗糖酶双基因（Lc-SacB1/Lc-SacB2）的功能分化现象，其催化特性与结构进化机制为糖基转移酶的功能多样性研究提供了新视角。

相较于传统芽孢杆菌来源的果聚糖蔗糖酶，Lc-SacB2展现出独特的催化优势。其Kcat为3.90 s-1，显著高于已报道的多数同源酶，如B. subtilis来源的果聚糖蔗糖酶（Kcat为0.12 s-1）。此外，重组酶Lc-SacB2合成的果聚糖分子质量达到4.0×106 Da，显著优于多数微生物来源酶的产物。与同类酶相比Lc-SacB2具有显著优势。例如B. subtilis来源果聚糖蔗糖酶的产物呈双峰分布，其中高分子质量组分（约2×106 Da）占比不足6%，主要产物为低分子质量果聚糖（约7×103 Da）；

B. methylotrophicus

SK 21.002和

B. licheniformis

RN-01的产物分子质量分别仅为5×103 Da和0.11×105～6.12×105 Da；T. sakaeratensis和A. diazotrophicus SRT4的产物分子质量分别为1.0×105～6.8×105 Da和2.0×106 Da 。高分子质量果聚糖（＞5×104 Da）在功能应用上展现出独特优势：分子质量超过3×105 Da的产物具有显著抗肿瘤活性，而7×104 Da左右的果聚糖对H5N1禽流感病毒及腺病毒40型表现出广谱抗病毒活性。在食品领域，高分子质量果聚糖作为益生元可有效调节肠道菌群，降低血清胆固醇及甘油三酯水平。为提升高分子质量果聚糖合成能力，研究者常采用分子改造策略，如Li Zhiwei等通过在SacB酶C端融合葡聚糖结合域，将产物分子质量提升至2×106 Da。本研究中Lc-SacB2无需结构修饰即可合成高分子质量（4.0×106 Da）果聚糖，其机制可能源于底物结合域中扩展的SH3_8结构域——该结构通过增加底物通道的空间容纳能力，显著促进果糖链的持续延伸。

本研究揭示了Lc-SacB1与Lc-SacB2在催化功能上存在显著分化现象。尽管二者序列同源性高达79%，但Lc-SacB1仅保留水解活性，而Lc-SacB2兼具高效的转果苷活性。通过三维结构建模与功能域对比发现，二者底物结合域的局部构象差异是功能分化的关键分子基础。Lc-SacB1的催化通道入口处存在一段由Thr316至Met325组成的延伸loop结构（图6B玫瑰红标注区），其关键残基Lys322和Gln323的较长侧链向催化口袋内部延伸，导致通道空间显著狭窄化。这一构象特征与B. subtilis来源果聚糖蔗糖酶的开放型底物通道形成鲜明对比（图6A），推测其阻碍了蔗糖分子进入活性中心并形成催化过渡态，从而抑制转糖基反应，仅保留水解功能。相比之下，Lc-SacB2对应区域（Glu346至Ala347）的侧链较短且空间取向更为灵活（图6C），形成与B. subtilis来源果聚糖蔗糖酶相似的开放型通道构象。这一结构优势不仅提升了底物分子的可及性，还为果糖链的延伸提供了更大的空间容纳能力，从而支持高分子质量果聚糖（4.0×106 Da）的高效合成。后续将对Lc-SacB1 Thr316至Met325组成的loop区域进行丙氨酸突变，检测突变体是否恢复转果糖基活性，以及通过分子动力学模拟解析底物结合过程中loop区构象的动态变化，阐明其如何调控蔗糖分子的空间取向与催化中间态形成。

本研究合成的β-(2,6)-果聚糖因具有高分子质量特性，在功能应用上展现出独特潜力。已有研究表明，高分子质量果聚糖较传统低分子质量产物具有更强的黏弹性、抗氧化活性及免疫调节功能，可拓展至食品质构改良、药物缓释载体及功能性化妆品开发等领域。然而，Lc-SacB2的产物分子质量分布调控机制仍需深入解析，未来可通过定向进化或底物工程优化其产物均一性。此外，双基因在宿主菌中的协同代谢调控网络尚未明确，需结合转录组学与代谢通量分析揭示其生理意义，为合成生物学改造提供靶点。

综上，Lc-SacB2的发现不仅丰富了果聚糖蔗糖酶资源库，其功能分化机制与高效催化特性为工业酶理性设计提供了新思路。后续研究将聚焦于其晶体结构解析与关键功能域定点突变，以进一步强化催化效率及产物可控性，推动果聚糖生物制造的产业化进程。

结 论

本研究通过基因组挖掘、异源表达与酶学表征，系统揭示了柠檬明串珠菌BD1707中果聚糖蔗糖酶Lc-SacB1/Lc-SacB2的功能分化机制及催化特性。Lc-SacB2表现出高效转果苷活性，催化蔗糖生成分子质量达4.0×106 Da的β-(2,6)-果聚糖，而Lc-SacB1因局部结构差异仅保留水解功能。动力学分析表明，Lc-SacB2的催化效率（Kcat/Km＝0.048 L/（s·mmol））略优于Lc-SacB1。通过分析2 种重组酶的环境适应性发现，Ca2＋通过稳定催化构象显著提升双酶活性（Lc-SacB1、Lc-SacB2相对酶活力分别提高了155%和134%）。Lc-SacB2合成的高分子质量果聚糖可能兼具益生元、抗氧化等生物活性，在食品增稠、医药载体等领域展现出应用潜力。本研究不仅可为果聚糖高效生物制造提供优质酶资源，还可为糖基转移酶的功能进化与理性改造奠定理论基础。

作者简介

第一作者：

杨婷，博士，现任光明乳业股份有限公司乳业研究院项目主管。2023年获华东师范大学生物化学与分子生物学博士学位，同年加入乳业生物技术国家重点实验室。长期从事合成生物学与乳业生物制造研究，主要方向包括：食品级微生物（枯草芽孢杆菌/马克斯克鲁维酵母）底盘细胞工厂设计；食品酶（淀粉分支酶/蛋白质谷氨酰胺酶）高效表达与分子改造；功能性多糖的生物合成与产业化应用。研究成果发表

于AMB Express、Current Microbiology、Nutrients

等SCI期刊，申请中国发明专利10 项。参与十四五国家重点研发计划项目（2022YFD2100704）；市国资委企业创新发展和能级提升项目（2022013）。

本文《柠檬明串珠菌BD1707果聚糖蔗糖酶功能分化及酶学特性》来源于《食品科学》2025年46卷第20期153-161页，作者：杨婷。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250407-042。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：杨倩；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。