破解HER2二聚体空间位阻：提升HER2 IHC检测灵敏度的新策略探索

新型Nby-Aby双靶点融合蛋白有望提升IHC检测灵敏度

HER2免疫组化（IHC）检测是乳腺癌（BC）诊断的重要方法，在指导个体化治疗策略中具有关键作用。然而，不同病理医师在判读IHC结果时存在不一致性，尤其对HER2低表达及阴性结果的判定差异显著，可能导致临床决策分歧，进而影响患者预后 [1]。由于HER2在细胞内同时以二聚体和单体形式存在，诊断抗体在HER2二聚体上的部分结合位点可能在检测过程中被遮蔽[2]。因此，准确检测HER2二聚体对提升IHC诊断精确度至关重要。

近期，一项研究通过比对HER2异源二聚体结构与帕妥珠单抗、曲妥珠单抗Fab段结合HER2的模式，发现二者结合区域存在重叠[3]。为克服HER2二聚体造成的空间位阻，研究使用结合HER2不同表位的亲和体（Aby）与纳米抗体（Nby），构建了融合蛋白（Nby-Aby）及人重链铁蛋白（HFn）纳米颗粒（Nby-HFn、Aby-HFn），并通过组织微阵列（TMAs）评估了Nby-Aby在乳腺癌组织中的检测性能。本文整理关键信息，供读者参考。

研究方法

HER2结合蛋白结构比对分析

为验证HER2二聚体可能产生的空间位阻效应，从PDB数据库获取HER2胞外域（PDB: 1n8y）及其与EGFR（PDB: 8hgo）、HER3（PDB: 7mn5）、HER4（PDB: 8u4k）、帕妥珠单抗/曲妥珠单抗Fab（PBD: 6oge）、Nby（PDB:5my6）和Aby（PDB:3mzw）的晶体结构。去除配体及水分子后，将所有结构与HER2-ECD进行对齐，并通过多色可视化分析结合位点分布。

Nby-Aby融合基因及HFn纳米颗粒质粒构建

通过优化原核表达序列，设计合成Nby-Aby融合基因（中间通过G4S连接肽串联，N端添加HA标签）及Nby-HFn、Aby-HFn纳米颗粒基因（N端通过G4S连接子与HFn融合，含HA标签）。所有基因合成后被克隆至pET21a(+)载体（NdeI/XhoI酶切位点），构建重组质粒。

蛋白表达与鉴定

将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达后，经Ni–NTA树脂纯化、透析及BCA定量。通过SDS-PAGE验证蛋白纯度，透射电镜（HT-7800，100kV，10万倍）观察纳米颗粒形态。

IHC候选试剂筛选

采用三步法IHC筛选最佳检测试剂。乳腺癌石蜡切片经脱蜡、抗原修复及封闭后，分别与200μg/mL HFn、Nby-Aby、Nby-HFn、Aby-HFn孵育过夜，以PBS为阴性对照，6μg/mL传统抗HER2抗体为阳性对照。HA标签一抗（1:200）及HRP标记二抗依次孵育，DAB显色后苏木素复染。

统计分析

采用SPSS 22.0比较Nby-Aby重评结果与初始诊断数据，分析其与ISH、Ki67、肿瘤大小的相关性。Fisher精确检验界定统计学差异（P<0.05）。

结构预测

通过AlphaFold预测Nby-Aby、Nby-HFn和Aby-HFn结构，与HFn晶体结构（PDB:5n27）比对分析，使用PyMOL与Nby-Aby一起进行多体可视化。

研究结果

Nby与Aby在HER2胞外域的结合区域不同于HER家族蛋白及帕妥珠/曲妥珠单抗Fab

通过比对PDB数据库中所有相关晶体结构，并将Nby和Aby与EGFR（图1A）、HER3（图1B）、HER4（图1C）、帕妥珠单抗和曲妥珠单抗Fab（图1D）的结合区域进行对齐，研究发现Nby和Aby与HER2胞外域的结合区域在空间上与上述蛋白均不重叠。Nby和Aby主要结合HER2胞外域的Ⅰ和Ⅲ结构域，这与HER家族蛋白的二聚化区域（Ⅱ结构域）及部分Fab片段在HER2上的结合位点（Ⅱ结构域）明显不同。

图1 不同蛋白在HER2胞外域的结合区域

Nby-Aby及HFn纳米颗粒的表达与鉴定

质粒构建并转化至E.coli BL21(DE3)后，经1mM IPTG诱导并通过SDS-PAGE鉴定，可见菌液在23kDa（Nby-Aby）、25kDa（HFn）、34kDa（Aby-HFn）和40kDa（Nby-HFn）处出现特异性条带（图2A），而未诱导组无相应条带。纯化后的蛋白也在对应分子量处呈现单一条带（图2A）。透射电镜结果显示，HFn、Aby-HFn和Nby-HFn均成功形成纳米颗粒（图2B）。

图2 Nby-Aby融合蛋白和HFn纳米颗粒的制备和表征

Nby-Aby在HER2 IHC检测中表现出优于传统抗体及HFn纳米颗粒的灵敏度

研究采用Nby-Aby、Aby-HFn、Nby-HFn、HFn和PBS进行IHC检测，并与传统方法进行了对比。结果显示，在案例1中（图3A），传统方法判定HER2评分为0，而Nby-Aby重新评估为2+，并识别出传统方法未检测到的癌细胞；案例2中（图3B），传统评分1+被Nby-Aby重新评定为2+；案例3中（图3C），传统评分2+被提升至3+；案例4中（图3D），所有检测蛋白与传统方法结果一致（2+或3+）。这些结果验证了研究假设：利用Nby-Aby结合不同区域以克服HER2 IHC中的空间位阻，能够提高HER2的评分。

图3 使用多种蛋白质探针和常规抗体对HER2表达进行IHC分析比较

Nby-Aby较传统抗体提高了HER2 IHC检测阳性率

为进一步减少其他抗体的潜在干扰并评估灵敏度提升，将Nby-Aby与HRP偶联后进行IHC检测。在TMAs-1样本（初始诊断为0和1+）中，Nby-Aby准确识别出组织中的癌细胞，并将HER2评分从0（图4A）或1+（图4B）提升至2+和3+；在初始诊断为2+的TMAs-2样本中，Nby-Aby进一步确认诊断或提升至3+（图4C）；初始3+样本仍维持3+（图4D）。Nby-Aby提升HER2评分及阳性率的潜在原因如图4E所示。

图4 使用Nby-Aby重新评估HER2 IHC评分并提出分数提升的可能机制

汇总Nby-Aby与初始诊断的HER2评分数据并结合补充信息（ISH、Ki67%和肿瘤大小）进行统计分析显示。将HER2评分与ISH结合时，初始诊断组的IHC阳性及低表达（1+、2+、3+）率为64%，而Nby-Aby诊断组为89%，差异十分显著（P<0.001）；结合Ki67或肿瘤大小时，在Ki67>30%且肿瘤尺寸≤2cm的组中，Nby-Aby与传统方法相比也存在显著差异（P<0.05）。这表明Nby-Aby可能更准确识别具有潜在侵袭性特征的肿瘤，其用于HER2IHC检测可较传统方法显著提高灵敏度。详细信息见表1。

表1 Nby-Aby诊断与初始诊断联合其他肿瘤指标评估的HER2表达水平比较

Nby-HFn、Aby-HFn及Nby-Aby的结构预测

为探究纳米颗粒效果不符预期的原因，研究者通过AlphaFold预测了Nby-HFn、Aby-HFn和Nby-Aby的晶体结构。分析显示，尽管Nby-HFn和Aby-HFn均能按设计自组装为纳米颗粒，但其HA标签暴露不充分（图5A、B），限制了与HA抗体的有效结合；尽管每个颗粒含24个HA标签，但在三步法检测中可及性较低。相比之下，Nby-Aby分子尺寸显著小于纳米颗粒（图5C），且HA标签未遮蔽。这解释了HER2结合纳米颗粒在三步法中效果不佳的原因，尽管其设计在理论上应提高灵敏度。

图5 Nby-HFn、Aby-HFn和Nby-Aby的预测结构

文章小结

研究表明，Nby-Aby融合蛋白通过双靶向和结合不同区域，显著增强了IHC中HER2的检测灵敏度，而不影响其二聚化。与传统的IHC方法相比，Nby-Aby提高了HER2 IHC评分并提高了灵敏度。这些发现表明，通过双靶向和结合HER2-ECD的不同区域可以减少空间位阻，提高IHC的诊断敏感性。研究仍存在局限性，如样本量有限且缺乏长期随访数据以确定使用Nby-Aby检测的HER2评分较传统方法增加的临床意义等。但总体而言，研究提示未来HER2 IHC检测中可能需要更多地关注试剂与HER2二聚化区域分开的双靶向或靶向区域，以进一步提高诊断准确性。

参考文献：

[1]Sajjadi E, et al. Improving HER2 testing reproducibility in HER2-low breast cancer. Cancer Drug Resist. 2022 Sep 1;5(4):882-888.

[2]Schrohl AS, et al. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies. Histopathology. 2011 Nov;59(5):975-83.

[3]Luo L, et al. Dual-targeting and steric hindrance resolution in HER2 IHC: a novel approach to improve diagnostic sensitivity. BMC Cancer. 2025;25(1):1231. Published 2025 Jul 29.

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审批编号：CN-171221 过期日期：2026-11-07

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