L-苯丙氨酸是一种必需氨基酸,具有多种有前景的应用。在食品工业上主要用作甜味剂阿斯巴甜的合成原料;在医药行业主要用于氨基酸输液和氨基酸类药物。
随着对 L-苯丙氨酸需求的增长,已经衍生出多种生产 L-苯丙氨酸的策略,包括化学、微生物或酶促过程产生。传统的化学合成原料昂贵,会产生毒副产物;微生物的过程相对清洁,之前已有报道利用大肠杆菌从葡萄糖合成 L-苯丙氨酸。
但是大肠杆菌的合成途径冗长,限制了 L-苯丙氨酸的产量。因此,需要寻找替代底物并建立简洁、经济有效的 L-苯丙氨酸生产途径。
近日,来自浙江大学/西湖大学的研究人员开发了一种人工生物转化工艺,从廉价的芳香族前体(苯甲醛或苯甲醇)合成 L-苯丙氨酸。此外,这项研究首次构建了辅因子自给自足的生物合成途径,无需任何额外的还原剂(例如甲酸盐)即可合成 L-苯丙氨酸。
相关研究以题为“Systematic engineering enables efficient biosynthesis of L-phenylalanine in E. coli from inexpensive aromatic precursors”发表在Microbial Cell Factories期刊。
通讯作者张科春于 2019 年全职加入西湖大学创建生物制造和新材料实验室。他的实验室主要应用合成生物、绿色化学、材料科学和工程优化等知识,设计绿色新化工生产路线和开发环保新材料,为循环经济向前发展提供新的解决方案。
在这项研究中,苯甲醇和苯甲醛因价格便宜获得优先考虑,价格分别为 2 美元/千克、2.5 美元/千克。此前,就有团队研究了利用苯甲醛作为底物,可以通过多酶偶联反应合成 L-苯丙氨酸。以苯甲醇为前体合成 L-苯丙氨酸的未见报道。
工程化 L-苯丙氨酸生物合成途径包括两个模块。
在第一个模块中,芳香族前体和甘氨酸转化为苯丙酮酸,这是 L-苯丙氨酸的关键前体。
研究人员从恶臭假单胞菌(LtaEP.p)、大肠杆菌(LtaEE.c)和新月柄杆菌CB15 (LtaEC.c) 中筛选了 3 个 LTA。经过验证,苏氨酸醛缩酶(LtaE P.p)是苯甲醛转化的最佳天然 LTA。其与苏氨酸脱水酶(A8H B.t)共表达来生产关键中间体苯丙酮酸。此时,苯甲醛向苯丙酮酸的转化率为 65%。
此外,脱氨酶基因 RidA 的过表达可以使苯丙酮酸产量进一步增加,达到 5g/L,苯甲醛实际转化率高达 77%。
第二个模块是催化苯丙酮酸生成L-苯丙氨酸,通过共表达苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)和甲酸脱氢酶(FDHV120S),10 小时内产生 11g/L 的 L-苯丙氨酸,相当于苯丙酮酸的转化率为 93%。
然后,含有这两个模块的工程大肠杆菌可以从苯甲醛生产 L-苯丙氨酸,L-苯丙氨酸滴度为 1.7g/L,苯甲醛转化率为 69%。
最后,团队扩展了芳香族前体,以苯甲醇为原料生产 L-苯丙氨酸,并首次构建了辅因子自给自足的生物合成途径,无需任何额外的还原剂(例如甲酸盐)即可合成 L-苯丙氨酸。
总之,这项工作描述了一种从廉价的芳香族前体(苯甲醇或苯甲醛)中简洁可行的生物合成 L-苯丙氨酸的方法。未来,可以通过筛选和进化更高活性的目标酶,进一步优化生物转化途径,提高苯甲醇生产 L-苯丙氨酸的效率。此外,还可以采用底盘细胞的代谢工程来进一步提高 L-苯丙氨酸生产的性能,例如增加底物的摄取、减少底物和产物的降解。
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