《食品科学》：宁夏大学李亚蕾教授等：秦川牛宰后成熟期间热休克蛋白A6对肉品质变化的影响机制

动物宰后缺氧缺血状态激活了细胞凋亡酶，在诱导细胞凋亡的同时，还诱导了热休克蛋白（HSPs）的合成，HSPs主要功能是作为分子伴侣与抗凋亡因子，通过阻止宰后肌肉成熟过程中的细胞凋亡、蛋白降解等对肌肉结构发挥防护作用。诸多研究表明，HSPs作为生物标记物在预测嫩度、肉色、保水性方面具有一定潜力。HSP70家族是HSPs最重要的亚族之一，热休克蛋白A6(HSPA6)是其家族成员之一，在活体细胞中的各个部分组成性地表达，其功能发挥对与ATP结合、ATP-ADP转化或HSPA6磷酸化诱发构象变化具有依赖性。 白质组学是研究特定状态或时期下组织或细胞全部蛋白质水平变化。目前，蛋白质组学方法在肉品质变化机制研究方面已有较为广泛的应用。

宁夏大学马旭华、李亚蕾*、罗瑞明等以宰后4 ℃条件下秦川牛背最长肌为研究对象，测定其能量水平变化和肉品质变化，采用4D-非标记定量(4D-LFQ)技术分析不同贮藏期牛肉蛋白质水平变化，结合基因本体注释（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，从分子层面明确HSPA6参与调控的通路，研究HSPA6影响能量代谢的途径，为后续从HSPA6变化角度阐明宰后肌肉组织能量代谢和品质变化机制提供参考。

1 宰后牛肉贮藏过程中品质的变化

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1.1 HSP70家族成员筛选及其表达量变化

采用4D-LFQ蛋白质组学技术研究秦川牛宰后蛋白质组的丰富度变化，利用Maxquant（v1.6.6.0）软件对所得的蛋白质二级结构进行质谱检索，共鉴定出1 149 个蛋白质，通过逐一搜索，仅筛选出HSP70家族成员HSPA6，其表达量变化情况如表1所示。HSPA6表达量在宰后0 d最大（1.51），随贮藏时间延长呈显著下降趋势（P＜0.05）。宰后初期由于动物缺血缺氧引起应激反应，HSPA6作为应激分子迅速被合成，因此0 d时其表达量较高，随成熟时间延长，蛋白质降解程度加剧，使其表达量显著降低。0～4 d其表达量降幅较低。

1.2 能量代谢基本物质ATP、ADP、AMP、NADH含量的变化

采用HPLC法检测宰后秦川牛背最长肌能量代谢基本物质含量，结果如表2所示。随着贮藏时间的延长，ATP含量呈显著下降趋势（P＜0.05），由0 d时的9.63 μmol/g下降至8 d时0.50 μmol/g，0～2 d期间下降速率较快，2～8 d降幅较缓，8 d时基本检测不出ATP。ADP、AMP的含量在整个成熟期（0～8 d）均呈显著下降趋势。结果表明，宰后由于有氧代谢逐渐减弱，组织中ATP迅速发生降解，促使糖酵解被激活，同时引起AMP、ADP含量下降。贮藏过程中NADH含量变化可反映组织细胞中氧化还原和能量变化状态。0～8 d期间NADH含量逐渐降低。

1.3 剪切力的变化

宰后成熟期间秦川牛背最长肌剪切力变化趋势如表3所示。牛肉贮藏0 d时剪切力为121.67 N，0～4 d期间显著上升，4 d达到其最大值（155.03 N），4～8 d呈显著下降趋势，8 d时剪切力为94.3 N。剪切力变化趋势表明，宰后初期秦川牛肉嫩度较差，秦川牛肉剪切力变化分析结果表明宰后成熟有助于改善肉品嫩度，适度条件的成熟有助于改善肉品嫩度是因为宰后内源酶被激活，有效加速细胞骨架蛋白的降解。

1.4 MFI的变化

如表3所示，MFI随成熟时间延长呈显著上升趋势（P＜0.05），贮藏0 d时MFI为30.30，8 d时达到整个贮藏过程的最高值（99.00），与0 d时相比增长了226.73%。MFI变化趋势表明，随着贮藏时间的延长，秦川牛肌肉结构蛋白的水解程度加剧，肌肉结构蛋白质在内源酶的作用下被降解为片段。

1.5 离心损失率的变化

如表3所示，宰后0～4 d时牛肉的离心损失率显著升高，4 d时达到最大值，4～8 d显著降低。表明4 d时牛肉中肌浆蛋白凝结到肌原纤维上，蛋白质溶解度下降，造成了水分的流失，离心损失率达到最大，保水性最差。

1.6 HSPA6表达量与能量物质及品质指标的相关分析

为探究宰后成熟期间秦川牛背最长肌中HSPA6与能量物质及肉品质的关系，对HSPA6表达量与能量基本物质及品质指标进行Pearson相关性分析。由表4可知，宰后成熟期间秦川牛背最长肌中HSPA6表达量与ATP含量、ADP含量、AMP含量、NADH含量、剪切力呈显著正相关（P＜0.05），相关系数r分别为0.529、0.542、0.578、0.737、0.550；与MFI、离心损失率呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数r分别为－0.771、－0.153；与ADP、AMP含量无显著相关性。本研究中HSPA6表达量与离心损失率也呈极显著负相关（P＜0.01），二者结果一致。

HSPA6作为HSP70蛋白家族成员之一，具有其家族特有的两个亚结构域：N端高度保守ATPase功能域和C端底物结合功能域，ATPase功能域具有水解ATP的活性，可以处于与ATP、ADP结合状态或者无核苷酸结合状态，C端底物结合功能域可以与未折叠多肽底物暴露在外的疏水区域结合。本研究中，宰后成熟期间秦川牛背最长肌中HSPA6表达量呈显著下降趋势，并与ATP、NADH含量呈显著正相关，结果表明HSPA6可能通过利用结构域具有ATP-ADP转换活性执行宰后成熟期间秦川牛肉中的蛋白翻译后修饰。

2 蛋白质组学数据分析

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设置1.3 倍为标准差异倍数，4 d与0 d、8 d与0 d、8 d与4 d相比分别鉴定出30、61、31 个差异表达蛋白质，并对3 个贮藏时间段样品的蛋白质组学结果进行蛋白质组间相关性分析，如图1所示。结果表明，贮藏时间可将样本很好地区分开，同一贮藏时间样本之间区分不明显，不同贮藏时间样本之间区分明显，表明本实验样本采集合理，蛋白质组学数据可靠，满足后续分析要求。

2.1 差异蛋白质筛选

通过Uniprot数据库对鉴定出的差异蛋白进行逐一搜索，通过功能特性筛选出24 种与HSPA6表达相关的差异蛋白质，并将其表达丰度与HSPA6表达量进行相关性分析，结果如表5所示。

2.2 GO分析

对差异蛋白质及HSPA6通过GO富集分析，通过生物过程、分子功能、细胞组分解析其功能，显著富集到9 个生物过程、8 个分子功能、8 个细胞组分，如表6所示。此类差异蛋白质能够催化复合体、蛋白质复合体、细胞骨架部分等位置发生变化，同时在细胞内具有催化、水解酶等活性，并通过与碳水化合物衍生物、嘌呤核苷三磷酸结合等分子功能，引起蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白质分解代谢、蛋白分解参与细胞蛋白分解等生物过程。

2.3 KEGG通路分析

对差异蛋白质及HSPA6进行KEGG通路富集分析，其显著注释于剪接体（bta03040）与内质网中蛋白质加工（bta04141），如表7所示。HNRNPK为异质性核蛋白K，是RNA结合蛋白。DNAJA2为细胞周期进程恢复基因2，该蛋白属于进化保守DNAJ/HSP40蛋白家族，通过刺激ATP酶活性来调节分子伴侣活性，DNAJ蛋白在体外蛋白质折叠导入中作为HSP70的辅助伴侣。剪接体是由核小RNA和蛋白质因子动态组成，可识别RNA前体并催化核糖核蛋白复合体的剪接反应。内质网中蛋白质加工过程包括蛋白质的糖基化、酰基化、羟基化等。以上结果表明，HSPA6参与了宰后成熟期间秦川牛肉中蛋白质翻译后修饰。

2.4 基于蛋白质组学研究秦川牛宰后贮藏期间HSPA6及相关差异蛋白变化

已知HSP70 N端ATPase功能域具有微弱的ATP水解活性和ATP合成活性，即ATP-ADP转换活性，会通过影响ATP合酶参与ATP合成与消耗从而影响机体细胞供能和耗能。HSPA6作为HSP70家族一员，缺血缺氧激活了细胞凋亡酶，同时应激诱导了HSPA6的合成，阻止宰后肌肉成熟过程中细胞凋亡，并保持或降低HSPA6对肌肉细胞蛋白质的影响。

HSPA6在细胞质中可与DNAJB4、E3泛素连接酶等伴侣蛋白共同作用，同时作为维持蛋白质稳定的重要参与者，在蛋白质折叠和降解中发挥作用，控制应激状态下的蛋白质稳态。HNRNPK是与mRNA结合的主要蛋白质，可能在RNA转录激活和抑制过程中发挥作用，促进细胞糖基化，诱导细胞凋亡。HSPA6可能通过ATP-ADP转换活性的功能降低组织能量水平，并通过抗细胞结构蛋白降解最终影响秦川牛肉的肉色、嫩度及保水性。

3 结 语

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宰后0～8 d内，随贮藏时间的延长，秦川牛肉中HSPA6表达量持续下降，ATP、ADP、AMP、NADH含量持续下降，剪切力与离心损率失先升高后降低。利用4D-LFQ蛋白质组学分析发现，贮藏0～8 d秦川牛背最长肌所含HSPA6及相关差异蛋白质表达量发生变化，这些蛋白质位于催化复合体、蛋白质复合体、细胞骨架，通过与碳水化合物衍生物、蛋白质或嘌呤核苷三磷酸结合，参与蛋白质分解代谢，引起蛋白质降解、细胞凋亡和蛋白水解等变化，进而影响肌肉结构发生变化，导致组织能量水平降低，最终影响秦川牛肉的嫩度、MFI及保水性。

本文《秦川牛宰后成熟期间热休克蛋白A6对肉品质变化的影响机制》来源于《食品科学》2023年44卷13期1-8页. 作者：马旭华，李亚蕾，罗瑞明，张杏亚. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220510-128. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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