Nature重磅：揭秘动物持久防御状态的神经机制

来源：神经元成像和行为学

加州理工大学、HHMI研究院神经科学家David J. Anderson研究团队于2020年9月16日在NATURE上发表论文“Stimulus-specific hypothalamic encoding of a persistent defensive state”，该文章使用了Inscopix公司提供的可以结合自由活动的超微成像技术，发现了下丘脑中缓慢的神经元群体动态有助于情绪状态的持续。

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大脑皮层、海马和运动网络中的持续神经活动被描述为调节短暂遇到的刺激的工作记忆。内部情绪状态，如恐惧，在受到刺激后也会持续存在，但尚不清楚这一过程是否涉及缓慢的神经动力学。在小鼠中，下丘脑腹内侧核和中央亚区(VMHdm/c)的神经元表达核受体蛋白NR5A1(也被称为SF1)是对捕食者做出防御反应所必需的。这些被称为VMHdmSF1的神经元，在光遗传激活时，会引发了比刺激更持久的防御行为，这表明了一种持续的内部恐惧或焦虑状态的诱导。

在这里，科研人员展示了在对自然的威胁刺激的反应中，小鼠的VMHdmSF1神经元表现出持续数十秒的活动。在实验中，这种持续的活性与持续的防御行为相关，并且依赖于VMHdmSF1神经元释放的神经递质。急性脑片的刺激和钙显像显示VMHdmSF1神经元之间存在局部兴奋性连接。使用Inscopix成像观察VMHdmSF1神经元，显示群体水平上的持续活动反映了个体细胞间的异质性动力学。

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出人意料的是，不同形式的威胁性刺激持续激活不同但重叠的VMHdmSF1亚群。计算模型表明，无论是反复的兴奋还是缓慢作用的神经调制本身都不能解释维持刺激同一性的持续活动。实验结果表明，下丘脑中特定刺激的缓慢神经动力学，在时间尺度上比皮层的工作记忆更持久，有助于形成持续的情绪状态。

科研人员对在居住笼中自由行为的小鼠的VMHdmSF1神经元表达了GCaMP6并进行记录，期间会让捕食者呈现10秒(麻醉的大鼠；图1a-c)。该信号在大鼠出现时迅速增加(图1d，e)，并在大鼠被移除后持续一分钟以上(时间常数τ衰减=26.7s±2.2s；图1d，h)。相比之下，放入玩具鼠的时候，神经反应更弱、更短(图1d，e)。随着试验和天数的增加，对多次呈现的大鼠的峰值反应降低，说明有了习惯化。

图1：捕食性和相似线索诱发的VMHdmSF1神经元持续活动

为了更好地控制刺激的呈现，科研人员重复了这个实验，使用头部固定的动物，将刺激封闭在铁丝笼中以防止接触。VMHdmSF1峰值反应因刺激而不同，对大鼠的反应最强，持续时间最长(图1f-h)。VMHdmSF1神经元的持续活动不太可能反映GCaMP6的缓慢衰减动力学(图2)。正如预期的那样，VMHdmSF1神经元对大鼠尿液有中度反应，对头顶隐约可见的圆盘刺激有微弱反应；对后者的防御性反应不需要VMHdmSF1神经元。

为了更好地测量自由活动动物的防御行为，并将它们与VMHdmSF1神经元活动相关联，科研人员设计了一种在开阔场地进行的大鼠暴露试验。一只小鼠被放入行为箱中，在熟悉环境10分钟后，在箱子里放入一只清醒的大鼠并靠近小鼠15秒。在大鼠放入后，小鼠表现出趋向性，这是焦虑增加的一个指标，并持续了几分钟(图1k-n)。

在一些小鼠中观察到冰冻、跳跃和瞬时速度减慢，但与大鼠前的基线没有显著差异。如果在大鼠被呈现并移走之后将小鼠放入行为箱，没有观察到这种行为，认为大鼠产生的气味不会导致这种行为。信号记录证实，VMHdmSF1神经元在大鼠呈现后持续激活，并且它们的动力学与趋触性相关。因此，持久的趋触性可以通过VMHdmSF1神经元的光遗传刺激来诱发。

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接下来，科研人员使用光门控氯离子通道IC++测试了VMHdmSF1活性是否是大鼠诱发的趋触性所必需的。首先，科研人员证实了IC++介导的VMHdmSF1神经元的抑制减少了对笼中大鼠的回避(图1i，j)，表现出对VMHdmSF1神经元的遗传消融。接下来，在旷场中，大鼠的暴露测试期间，从大鼠出现之前或之后的5秒开始，这些神经元连续抑制3分钟(图1l，红色与绿色条带)。在大鼠暴露之前开始的抑制阻止了趋触性的增加(图1l-n)。当大鼠被移除后开始抑制时，小鼠表现出最初的趋触性增加，但它比对照组更快地恢复到基线(图1l-n)。因此，持续的VMHdmSF1神经元活动对于维持对捕食者的持久防御反应至关重要。

为了测试大鼠诱发的持续VMHdmSF1活动是否需要在这些谷氨酸能细胞中反复激发，科研人员在神经元中表达了一种CRE依赖的破伤风毒素轻链-GFP融合(TetTox-GFP)来阻止它们的神经递质释放，以及红色钙指示剂jRGECO1a(图1o)。

钙信号记录显示，表达TetTox-GFP的小鼠在大鼠暴露后显示出比对照小鼠(注射jRGECO1a和EYFP)更快的整体钙衰减动力学(图1p，r)，而峰值反应没有受到影响(图1q)。离体生理学表明，VMHdmSF1神经元通过单突触和双突触谷氨酸能通路相互连接，成像显示，电刺激单个VMHdmSF1神经元激活多个跟随细胞。这些数据表明，至少在一定程度上，局部的经常性连接是持续的VMHdmSF1活动的基础，但不排除来自远端目标的反馈的作用。

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为了研究在单细胞分辨率下大鼠诱发的持续活动背后的神经动力学，科研人员在VMHdmSF1神经元中进行了Inscopix头戴式显微钙成像(图2a，b)。头部固定的小鼠在10s的伪随机刺激集呈现期间连续3天成像(图2c；n=5只小鼠，每天成像187.3±8.1个细胞，在几天内跟踪78个细胞)。VMHdmSF1群体反应在大鼠呈现后持续存在(图2c，d)，但单个神经元显示出多样化但可重现的刺激诱发动力学(图2e-g)。

许多细胞在刺激开始时被激活，但另一些细胞只有在刺激被移除后才达到顶峰。因此，群体反应的缓慢衰减反映了个体细胞之间不同的、随时间演变的活动模式(图2j-o)。来自VMHdm神经元的在体电生理记录证实了这些特异的动力学，排除了缓慢的GCaMP6s动力学假象。值得注意的是，对大鼠和小鼠呈现的反应部分重叠但不同(图2h，I)。强反应细胞的刺激选择性在几天内保持稳定，尽管一些神经元表现出逐渐递减的反应，这表明习惯性。

图2：Inscopix头戴式显微钙成像显示持续性来自群体活动

在啮齿动物中，非挥发性气味线索可以在吸入后激活VNO的神经元几秒钟，这增加了大鼠暴露后的持续活动反映了鼻黏膜中残留的酮的可能性。在这种情况下，科研人员预计只能观察到对时间分辨的非嗅觉刺激的瞬时反应，例如纯粹的视觉或听觉提示。VMHdm神经元对头顶视觉威胁刺激反应不强。

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因此，科研人员对VMHdmSF1的活动进行了显微钙成像，以响应激发小鼠防御行为的听觉刺激：在大约20 kHz范围内进行的一系列超声波扫描(USSs)，这是典型的大鼠求救发声。被捕食的动物可能会使用捕食者的叫声来触发防御行为，这一策略被称为窃听。

通过显微钙成像的数据显示，USSs强烈而持久地激活VMHdmSF1神经元(图3a，b)。与对大鼠呈现的反应类似，单个VMHdmSF1神经元表现出不同的动力学(图3c-f)。USS反应神经元与大鼠反应神经元在空间上混合在一起，有些对两种刺激都有反应(图3g-j)。在被识别为对一个或多个刺激有反应的神经元中，31%只对一个刺激有反应，超过50%对五个测试刺激中的一个或两个有反应(图3k)。大多数对刺激反应敏感的VMHdmSF1神经元都表现出兴奋性反应，但也有少数被抑制(图3d，l)。

群体活动的第一个主成分(PC)反映了刺激类别(大鼠、小鼠或玩具对听觉刺激)，第二个主成分从最初的试验到后来的试验都有所下降，可能反映了新颖性或显著性(图3n)。一个贝叶斯解码器能够在持续三天的成像试验中以高于概率的准确性预测刺激身份(图3m)。值得注意的是，刺激身份在刺激开始后的几十秒内也是可解码的。因此，即使在去除刺激之后，VMHdmSF1群体响应也可以持久地编码所呈现的刺激的身份。

图3：VMHdmSF1神经元对威胁性听觉刺激作出反应，并编码刺激身份。

科研人员提供的证据表明，下丘脑缓慢的神经动力学可能会导致持续的防御性情绪状态。反过来，VMHdmSF1的活性可能激活神经内分泌过程，而神经内分泌过程是更持久状态的基础。

与循环激素不同的是，VMHdmSF1神经元中的持续活动是刺激特异性的，防止了防御反应的过度泛化。这样的反应可能不仅包括趋触性，而且还包括进食抑制，这是一种也由VMHdmSF1神经元控制的焦虑反应。观察到的慢动态可以用包含快速反馈抑制和慢速神经调节传递的递归兴奋网络来最好地建模。反馈抑制可由邻近下丘脑背内侧的GABA能(γ-氨基丁酸释放)神经元提供。VMHdmSF1神经元表达近40个神经肽和115个G蛋白偶联受体，与优化模型的特征一致。

科研人员不能排除慢速动力学的其他细胞机制，例如星形胶质细胞清除K+。值得注意的是，VMHdm的上游输入杏仁内侧后卵圆核(MeApv)对不同的威胁刺激显示出不重叠的反应，但这些反应不是持久的，这表明VMHdm的持久性不是简单地遗传自MeApv。然而，不能排除来自VMHdm下游目标的中尺度反馈有助于维持持续性的可能性。数据表明，下丘脑中缓慢的神经元群体动态有助于情绪状态的持续。

参考文献：

Ann Kennedy, David J. Anderson et al., Stimulus-specific hypothalamic encoding of a persistent defensive state, Nature（2020）.

校审：Simon（brainnews编辑部）