Nature丨突破遗传密码扩展技术中细胞内底物摄取效率低下瓶颈——劫持细菌转运蛋白，解锁遗传密码扩展新纪元

撰文丨易

遗传密码扩展技术是蛋白质科学领域的一项革命性工具，它允许科学家在活细胞中定点、特异性地将非经典氨基酸整合到蛋白质中。这项技术通过使用正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA对，能够将各种具有特殊功能的化学基团——如生物正交手柄、交联剂、翻译后修饰模拟物等——精确地安装到目标蛋白质的特定位点，从而极大地扩展了蛋白质的功能多样性，为基础研究和生物技术应用开辟了广阔前景。然而，尽管潜力巨大，该技术的广泛应用长期以来受到一个关键瓶颈的限制：非经典氨基酸在细胞内的掺入效率低下。这导致蛋白质产量低、实验成本高昂。以往的研究多集中于优化合成酶系统或改造翻译机器本身，但一个未被充分探索的根本性障碍在于非经典氨基酸本身的“细胞内生物利用度”。大多数策略依赖于非经典氨基酸通过被动扩散或内源性氨基酸转运蛋白进入细胞，这种方式效率极低，尤其对于与合成酶配对催化效率不高的非经典氨基酸而言，细胞内底物浓度不足会严重限制其掺入。虽然有为数不多的研究尝试通过工程化细菌的内源性生物合成途径在细胞内直接生产非经典氨基酸，但这种方法适用性窄且改造过程复杂。因此，开发一种通用、高效的策略来主动提高细胞内非经典氨基酸的浓度，是推动遗传密码扩展技术发展的一个关键且尚未完全开发的方向。

近日，苏黎世联邦理工学院Kathrin Lang在Nature期刊上发表题为Hijacking a bacterial ABC transporter for genetic code expansion的研究论文，通过“劫持”细菌的Opp ABC转运蛋白，使其主动摄入易于合成的异肽键连接三肽，从而在细胞内高效释放非经典氨基酸（ncAAs），成功突破了遗传密码扩展技术中长期存在的细胞内底物摄取效率低下的瓶颈。该方法不仅实现了多种高难度ncAA的高效编码，还能通过定向进化工程化转运蛋白，实现在廉价培养基中的高效应用乃至单蛋白内双ncAA的协同掺入。

本研究的核心方法是巧妙地“劫持”细菌固有的一种高亲和力主动运输系统——寡肽渗透酶ABC转运蛋白系统，来突破ncAA摄取的瓶颈。作者团队 首先偶然发现，当将 ncAA中的 AisoK以三肽G-AisoK（甘氨酸-异肽键连接的丙氨酸-赖氨酸）的形式提供给大肠杆菌时，其掺入效率远超直接添加自由的AisoK。这一现象提示存在一种主动的运输机制。通过系统的基因敲除筛选， 作者 成功地将这个转运系统鉴定为Opp（oligopeptide permease）ABC转运蛋白，该系统的五个组分（OppA, OppB, OppC, OppD, OppF）任何一个的缺失都会完全废除G-AisoK的摄取。同时，他们发现细胞内的氨肽酶PepN和PepA能够将摄入的三肽切割，释放出自由的AisoK用于蛋白质合成。

基于这一机制， 作者 构建了一个通用的“三肽前药”平台：将任何想要掺入的 ncAA 作为X，嵌入到G-XisoK的分子骨架中。晶体结构分析揭示 ， OppA的结合口袋主要与三肽的骨架和两端发生相互作用，而对中间X位置的侧链则处于一个宽敞的空腔中，没有形成特异的紧密接触，这从原子层面解释了为何该转运体能够容纳多种多样侧链结构不同的G-Xiso K三肽 ， 证实了该平台的普适性。 利用这一平台，作者 证实，通过简单地更换X位置的残基，该平台能够高效编码11种此前难以获得的 ncAA ，极大地拓展了遗传密码扩展的化学多样性边界。这些氨基酸的功能涵盖多个重要领域：包括模拟细胞内关键的翻译后修饰（如丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸与赖氨酸的异肽键连接），这为在天然背景下研究这些修饰的功能提供了独一无二的工具；也包括用于生物正交标记的丙炔基氨基酸，其掺入效率甚至优于经过专门进化的合成酶系统； 此外 ，该平台还实现了多种交联剂的高效编码，例如光激活交联剂光亮氨酸和能够与附近半胱氨酸发生SN2烷基化反应的氯代丙氨酸，后者成功应用于稳定多种低亲和力的蛋白质相互作用复合物，展示了其在绘制和操控蛋白质相互作用网络方面的巨大潜力。

为了克服在营养成分复杂的培养基中内源性线性短肽与G-XisoK竞争OppA结合的问题， 作者 开发了一个高效的高通量定向进化平台，通过荧光激活细胞分选技术，筛选OppA的突变体库，最终获得了偏好性结合G-XisoK而非天然线性三肽的优化变体OppA-iso，并构建了相应的工程化菌株IsoK12。结合实验证实，OppA-iso对G-XisoK的结合亲和力略有提升，而对代表培养基中竞争性线性三肽的GSK的结合力则显著下降，这种选择性的改变使得IsoK12菌株在丰富培养基中表现出色，其细胞内目标氨基酸的浓度和蛋白表达产量均恢复到甚至超过了基础培养基中的高水平。IsoK12菌株的优势是全方位的：它不仅对所有测试的G-XisoK三肽都有效，还将所需的工作浓度降低了整整一个数量级，大幅节约了成本；它适用于从7 kDa到85kDa的一系列大小和功能各异的蛋白质，并能实现高效的多位点（单点、双点乃至三点） ncAA 掺入，其产量远超传统方法，为制备复杂修饰蛋白铺平了道路。

更进一步， 作者 将此策略推广到Z-XisoK三肽，其中N端的Z也可以是各种 ncAA ，并再次通过定向进化获得了能高效转运带有庞大或带负电荷的Z残基的三肽的OppA变体（OppA-Z1/Z2），从而实现了对多种原本细胞穿透性极差的氨基酸（如脂化赖氨酸、琥珀酰化赖氨酸等）的高效输送。

总而言之， 这些丰富而系统的结果表明，对细胞转运系统的主动工程化是解锁高效遗传密码扩展的一把关键钥匙，从根本上解决了底物摄取的瓶颈，并将该技术的应用范围推向了新的广度与深度。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-09576-w

制版人： 十一

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