Cell | 张鑫团队基于时间与光谱维度的协同解析发展新型时间分辨荧光蛋白用于活细胞多重成像

荧光显微镜技术作为生命科学研究的核心手段，已广泛应用于细胞成像与动态分析领域。目前最常用的荧光检测模式为稳态荧光成像，主要依赖荧光强度的测量；另一方面，时间分辨荧光则通过检测荧光发射随时间衰减的动力学过程来反映荧光寿命特性，为成像提供了另一维度的信息。荧光蛋白衍生物家族近年来不断扩展，为稳态成像提供了多种关键的光学特性。然而，尽管光谱性能得到显著优化，针对荧光蛋白寿命参数的系统性调控研究仍处于初步阶段，其分子机制与设计策略还远未完善。多重成像是一种极具前景的技术方向，它能够在同一活细胞环境中同时可视化多个生物靶点，从而系统揭示它们的生成、转运、相互作用及功能调控网络。但由于现有荧光蛋白发射光谱在可见光区域内存在显著重叠，传统基于稳态荧光的成像方法难以实现超过六种蛋白的有效区分。 荧光寿命成像显微镜（ FLIM）为该瓶颈提供了重要的补充路径。但基于荧光蛋白的 荧光寿命多重成像仍相对滞后。如何系统调控荧光蛋白的荧光寿命，发展具有寿命差异的新型荧光蛋白标签，并在此基础上建立活细胞高时空分辨率的多重成像新范式，已成为该领域一项关键且亟待突破的前沿挑战 。

2025年9月22 日，来自西湖大学理学院化学系的张鑫团队在 Cell 发表了题为 Time-resolved fluorescent proteins expand fluorescent microscopy in temporal and spectral domains 的研究论文。本研究中，该团队开发出一类新型时间分辨荧光蛋白（tr-FPs），其发射光谱覆盖整个可见光区（383–627 nm），荧光寿命可在1–5ns范围内调控。基于此技术，研究人员在活细胞中实现了9种靶向蛋白的多重动态成像，并成功将传统Fucci细胞周期探针升级为仅需单一通道的时间分辨版本（tr-Fucci）。该技术进一步应用于多重超分辨荧光寿命成像， 成功实现了 四种细胞器与细胞骨架蛋白的 超分辨成像 ，并 提供 了 活细胞内 蛋白质化学计量比 计算的新工具 。该项研究为荧光蛋白开发与活细胞成像提供了创新性技术平台。

本研究首先选用高亮度、长寿命且不同光谱特征的 mTurquoise2、mNeonGreen及mScarlet作为荧光蛋白 模板 ，对其发色团周围关键氨基酸进行了系统饱和突变。经过多轮筛选，成功获得一系列光谱性质稳定而荧光寿命差异显著的时间分辨荧光蛋白（tr-FP）变体。 为进一步探究亚细胞环境对荧光寿命的影响，团队还将 12种tr-FP变体分别靶向不同 亚 细胞区室，成像结果表明 亚细胞 定位对 荧光 寿命影响较小，tr-FP的寿命主要仍由发色团邻近的氨基酸突变所决定。

图1： tr-FP 靶向不同亚细胞结构的荧光寿命

在机制层面，研究团队发现 tr-FP的荧光寿命变化主要源于发色团邻近残基的定点突变。结构生物学分析表明，位于发色团电子供体基团（EDG）3.5 Å范围内的氨基酸残基对荧光寿命缩短效应贡献最为显著；位于2–5 Å范围内的残基则产生次要调控作用。通过计算这些变体的辐射衰减速率（ kᵣ ）与非辐射衰减速率（ kₙᵣ ），并结合量子力学/分子力学（QM/MM）模拟和分子动力学（MD）分析，研究揭示短寿命变体在激发态下呈现发色团扭转构象，阻碍了其快速恢复至平面基态，从而增大了非辐射衰减途径的比例；而长寿命变体则倾向于保持平面构 型，寿命较长。飞秒瞬态吸收光谱实验进一步从激发态动力学角度验证了不同寿命类别变体之间的衰减行为差异，为理性设计寿命可调的荧光蛋白提供了坚实的理论依据和实验支持。研究团队还将该突变策略成功拓展至 EBFP2、mVenus、mOrange及mKate2等多种发光颜色不同的荧光蛋白，最终构建出一套覆盖全可见光谱的“彩虹”tr-FP分子工具库，包含基于七种母体的28个荧光寿命差异显著的变体。

图 2 ：具有不同激发，发射以及荧光寿命的tr-FPs

在应用层面， tr-FP展现出卓越的多重动态成像能力。研究人员 首先 将三种 基于 mTurquoise2 并具有 不同 荧光 寿命 的 tr-FP s与 线粒体、溶酶体 以及 微管 相关蛋白融合 ，在HeLa细胞中表达，并在单一光谱通道中利用荧光寿命显微技术成功区分出不同 亚细胞定位。此外， 该团队 还 在活细胞水平同步解析了线粒体、溶酶体与微管的动态运动过程，不仅实现了长达4分钟的实时观测，还捕捉到溶酶体特有的“走走停停”迁移模式，为细胞器互作与运输机制研究提供了新的视角。

图 3 ：基于 mTurquoise2 靶向线粒体，溶酶体以及微管的动态成像

通过使用三个光谱通道的 tr-FP标记六种亚细胞结构（包括内质网、高尔基体、线粒体、过氧化物酶体、细胞核与微管），并在三维视角下系统展示其互作网络，该研究深刻揭示了细胞内部组织结构的高度复杂性与动态特性。更令人瞩目的是，团队成功实现了九种蛋白质在同一细胞视野下的同步可视化与独立成像，即使在高密度标记条件下仍能通过寿命特征进行精确分离，为在复杂生理环境下研究多分子事件、生物大分子组装及信号转导网络提供了可靠手段。

图 4 ：tr-FP靶向9种不同亚细胞结构荧光寿命成像

在重要生物学问题研究中， tr-FP被用于考察铁死亡和氧化应激条件下多种细胞器与细胞骨架的动态响应模式。发现在铁死亡过程中，内质网发生快速皱缩、碎裂和空泡化；线粒体形态由杆状转变为颗粒状；过氧化物酶体整体结构仍保持完整，但发生向心性聚集。而在氧化应激条件下，肌动蛋白丝和细胞核发生快速降解，表现出与铁死亡不同的动态特征。这些响应模式在两种应激条件下既存在共性又具明显差异，深化了人们对细胞死亡机制的理解，也为相关疾病机理研究和药物开发提供了新的可视化依据。

此外，该研究还创新性开发出时间分辨 Fucci（tr-Fucci）系统，可在单一光谱通道中实现对细胞周期进程的高精度监测，极大释放了其他光谱通道的容量，使其可用于同时观测细胞周期依赖的生物分子活动。利用该系统，团队评估了CDK4/6抑制剂对细胞周期进程的影响，发现其可阻断G1/S期过渡，并促使细胞从G2期直接退回G0/G1期，跳过M期。这些发现为了解细胞周期调控机制提供了新的视角。同时，研究还系统揭示了亚细胞器在细胞周期各阶段中的分离与再分配行为，如线粒体在G2至M期发生碎裂，高尔基体在M期解聚并在G1期重新组装，溶酶体与高尔基体在M期存在显著的空间重叠，提示其间可能存在功能性的动态互作，这些发现深化了对细胞分裂过程中细胞器分配机制的理解。

图5：不同细胞周期下表达出不同荧光寿命的蛋白

在超分辨成像领域， tr-FP也展现出优异性能。研究将具有高亮度和良好光稳定性的荧光蛋白oxStayGold（oxSG）进行寿命工程化改造，筛选出多个寿命差异显著的变体，并将其用于受激辐射损耗-荧光寿命成像（STED-FLIM），显著提升了成像分辨率和多重能力。在活细胞成像中，即使用STED激光照射后寿命值有所降低，不同tr-FP变体之间仍保持足够的寿命对比度，可实现两种甚至多种目标的超分辨区分，为细胞纳米结构研究提供了新型工具。

图6：基于荧光寿命的超高分辨 STED成像

最后，团队还成功建立了基于荧光寿命的蛋白质化学计量定量方法，将荧光寿命值与化学计量比关联，实现了活细胞内部蛋白复合物的定量分析。利用该方法，研究人员准确测定了核孔复合体蛋白 NUP96与NUP107的化学计量比为1.1，并与已有报道结果一致；还系统比较了不同内部核糖体进入位点（IRES）和2A肽在哺乳动物细胞中的表达效率，为合成生物学和基因表达调控研究提供了重要参考。这一方法为在活细胞环境下研究生物大分子组装、复合物形成及代谢调控过程提供了全新的定量工具。

该研究系统性地发展了荧光蛋白荧光寿命的理性调控策略，构建了覆盖全可见光谱的tr-FP工具库，并成功应用于动态多重复合成像、超分辨寿命成像和定量分析中，显著拓展了荧光显微镜在复杂生命体系研究中的能力边界。这一系列工具和方法将为细胞生物学、发育生物学、神经科学和病理学研究提供强大的成像支持，有望在未来成为生命科学基础研究与转化应用中的标准技术之一。

图 7 ：tr-FPs的荧光寿命调控，机制解析以及应用

本研究由西湖大学理学院助理研究员谈自主、熊家亨与博士生冯嘉辉共同担任第一作者，张鑫教授为通讯作者。合作团队包括西湖大学杨汶醒教授、叶宇轩教授、万奕含教授、卢培龙教授、邹贻龙教授，以及上海工程技术大学高雅教授、华东师范大学朱通教授、中国科学院大连化物所刘宇研究员和华盛顿大学李晓松教授等多位学者。

https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(25)01027-X

制版人： 十一

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