J VIROL. | 自噬在非洲猪瘟病毒感染早期促进 p72 降解和衣壳分解

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所翁长江研究员团队2024年12月发表在Journal of Virology杂志上的一篇名为“Autophagy promotes p72 degradation and capsid disassembly during the early phase of African swine fever virus infection”（自噬在非洲猪瘟病毒感染早期促进 p72 降解和衣壳分解）的文章。在这篇文章中，作者发现在ASFV感染的早期阶段，自噬促进了p72的降解和衣壳的分解。从机制上讲，Stub1通过HSPA8促进ASFV p72的多泛素化。多泛素化的p72随后与自噬受体SQSTM1 / p62相互作用，导致其通过选择性自噬途径降解。这些发现揭示了p72通过自噬降解的机制，并为ASFV衣壳解体过程提供了新的见解。

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种高度传染性疾病，会影响家猪和野猪，死亡率高达100％。ASF疫情对全球养猪业构成持续威胁。目前尚无有效的疫苗或抗病毒药物可用于预防和控制。ASFV 是一种复杂的核质大 DNA 病毒，其特征是二十面体多层结构，由 ASFV B646L 基因编码的主要衣壳蛋白 p72 约占病毒体总质量的 31%–33%，使其成为感染猪中检测到的主要抗原之一。在 pB602L 的帮助下，p72 正确折叠并组装成热稳定三聚体。三聚体 p72 折叠之间的插入物共同形成螺旋桨状顶部结构，延伸到病毒体外部，很可能是细胞表面的受体结合区域。

自噬是真核细胞中一种保守的“清除”机制，通过降解和循环利用细胞内成分来维持细胞稳态和有序的生命活动。病毒感染通常会诱导自噬来降解病毒成分或病毒体。已发现有几种自噬受体参与此过程。这些受体特异性地结合其底物并通过自噬诱导其降解。虽然选择自噬底物的确切机制尚不清楚，但泛素化被认为是自噬错误折叠和降解聚集物的潜在信号。然而，自噬在ASFV中病毒体和病毒蛋白降解中的作用尚不清楚。

在本研究中，作者使用抗 p72 抗体和 NHS 酯标记的病毒体，发现在 ASFV 感染的早期阶段，ASFV 病毒体与猪肺泡巨噬细胞 (PAM) 中的自噬体和自噬溶酶体共定位。随后，作者发现 p72 降解是通过自噬途径发生的。并且自噬介导的 p72 降解也有助于衣壳解体。作者的研究结果揭示了 ASFV 病毒体在 ASFV 感染早期通过自噬解体的一种新机制。

为了研究 ASFV 感染对自噬调节的影响，作者在用ASFV 感染PAM后 1、4、6、12 和 20 小时（hpi）收取样品。结果发现 LC3-II 的表达在 1 hpi 时增加，但随后在 6、12 和 20 hpi 时降低（图 1A）。为了加强对 ASFV 感染早期和晚期自噬体形成的比较分析，作者用 ASFV 感染 PAM 以检查 LC3 的定位。如图 1B 所示，在感染 ASFV 1 小时的 PAM 中，LC3 蛋白呈现出红色荧光斑点，与阳性对照组中观察到的斑点相当，表明自噬体形成。相比之下，在未感染细胞或感染 ASFV 24 小时的 PAM 中均未检测到此类斑点。这些发现表明ASFV在感染早期立即形成自噬体，而在感染后期抑制自噬。

为了评估ASFV感染引发的自噬体是否与病毒粒子或其组分共定位，作者在2 hpi和20 hpi分别感染以5MOI和1MOI 感染ASFV，观察p72和LC3的定位。如图1C所示，抗p72标记的病毒粒子在2 hpi时与红色荧光LC3点部分共定位，但在感染后期，LC3和新合成的p72几乎没有共定位。

由于SQSTM1/ p62在自噬过程中起关键作用，对病毒感染具有反应性，并且易于检测，因此与LC3一样，被广泛用作研究自噬的标志性标记。因此，作者观察了p72和LC3的定位，作者发现自噬受体SQSTM1/p62点在2 hpi时与抗p72标记的病毒粒子共定位，而不是在20 hpi时(图1D)。为了研究在相同处理条件下不同感染阶段PAMs中病毒颗粒蛋白和自噬体的定位，作者使用抗pE120r和抗p72抗体标记衣壳蛋白。值得注意的是，在感染早期的细胞中观察到衣壳点与SQSTM1/p62共定位，这种模式在感染后期的细胞中并不明显(图1E)。

这些结果表明，ASFV感染引发的自噬小体在感染早期可能与病毒粒子共定位。先前的研究表明，纯化的病毒粒子可以用Alexa Fluor 647 NHS酯共价标记。为了进一步证明在ASFV感染的早期阶段是病毒颗粒而不是病毒成分进入自噬体，作者用NHS酯标记的ASFV在4°C吸附1 h，然后在37°C孵育30 min，并观察ASFV病毒粒子的亚细胞共定位。如图1F所示，作者观察到抗p72抗体标记的斑点、SQSTM1/p62和NHS酯标记的ASFV病毒粒子共定位。通过SQSTM1/p62募集LC3对于自噬体的形成至关重要。作者测试了内化ASFV病毒粒子是否与LC3和SQSTM1/p62共定位，发现可以观察到标记病毒粒子、LC3和SQSTM1/p62共定位(图1G)。这些结果表明，内化的ASFV病毒粒子可以在ASFV感染过程中转移到自噬体中。自噬体-溶酶体融合是病毒降解的重要步骤。为了进一步确认ASFV病毒粒子是否进入了自溶酶体，作者用NHS酯标记的ASFV病毒粒子感染PAMs 30分钟，检测病毒粒子、SQSTM1/p62和LAMP2(溶酶体标记物)的共定位。如图1H所示，ASFV颗粒与SQSTM1/p62和LAMP2共定位，表明ASFV病毒粒子在感染早期就进入了自溶酶体。

内化后，ASFV病毒粒子沿着自噬体-溶酶体途径移动，主要存在于30 mpi时猪巨噬细胞的LEs和溶酶体中，在那里ASFV颗粒脱壳。为了测量ASFV感染的PAMs在病毒感染早期SQSTM1/p62 +囊泡中内化病毒粒子的比例，在5、15和30 mpi时计数自噬体(SQSTM1/p62标记)和内体(包括RAB5 +EEs和RAB7 +LEs)中NHS酯标记的ASFV数量。如图1I所示，大约70%的NHS酯标记ASFV病毒粒子在5和15 mpi时与rab5阳性囊泡共定位，尽管在30 mpi时这一比例有所降低。相反，作者观察到大约31.26%，40.59%和59.66%的NHS酯标记ASFV病毒粒子分别在5，15和30 mpi时与rab7标记的LEs共定位。在5、15和30 dpi处，分别有35.50%、35.74%和42.45%的病毒粒子与自噬体定位。总的来说，这些发现清楚地表明，在ASFV感染的早期阶段，部分内化的ASFV病毒粒子可以运输到PAMs中的自噬体或自溶体。

图1. 内化的ASFV病毒粒子在病毒感染的早期阶段进入自溶酶体

为了进一步证明ASFV病毒粒子可以定位于自噬体，作者使用蔗糖密度梯度离心分离了ASFV感染的PAM的细胞裂解物。如图2A所示，衣壳蛋白p72和内膜蛋白p54与自噬相关成分(SQSTM1/p62, LC3和RAB7)在相同的分层中发现，但与RAB5无关。为了验证衣壳蛋白的主要成分是否可以被自噬靶向，作者用表达FLAG-p72的质粒转染HEK293T细胞，然后用蛋白酶体抑制剂(MG132)和溶酶体抑制剂如BafA1、氯喹(CQ)和NH4Cl处理。如图2B所示，所有三种溶酶体抑制剂均抑制p72的降解，表明p72是通过自噬途径降解的。

自噬货物被自噬受体选择性捕获，并运输到细长的自噬膜上进行选择性降解。SQSTM1/p62、NBR1、OPTN、NDP52、TAX1BP1和CCDC50已被鉴定为自噬受体。为了确定哪种自噬受体控制p72的自噬降解，用表达指示蛋白的质粒转染HEK293T细胞，并进行共免疫沉淀(Co-IP)试验。如图2C所示，P72主要与SQSTM1/p62、OPTN和NDP52相互作用。作者还发现只有SQSTM1/p62与p72共定位并在HEK293T中形成聚合体(图2D)。p72与内源性SQSTM1/p62之间的相互作用在ASFV感染的PAMs中得到证实(图2E)，作为对照的内膜蛋白p54不与这些自噬受体相互作用。这些结果表明，SQSTM1/p62在p72相关的自噬中起着重要作用。

泛素化底物可以被自噬受体中存在的Ub结合域(UBDs)通过与Ub结合而识别。先前的研究表明，位于SQSTM1/p62 c端的UBD (UBA)结构域可识别泛素化底物。为了确定SQSTM1/p62的哪个结构域是p72自噬降解所必需的，构建了两个表达UBA结构域缺失(ΔUBA)或lc3相互作用区(LIR)缺失(ΔLIR)的SQSTM1/p62突变体的质粒。Co-IP结果显示，与SQSTM1/p62相比，当UBA结构域丢失时，p72与SQSTM1/p62之间的相互作用明显受损(图2F)。说明SQSTM1/p62的UBA结构域负责识别泛素化底物，这也是其与p72相互作用所必需的。为了检测p72是否在ASFV感染的细胞中多泛素化，作者将p72感染ASFV 2或20 hpi，并用抗p72和抗Ub抗体染色。如图2G所示，共定位结果显示，绝大多数Ub在2 hpi时与p72以点形式共定位，而在20 hpi时与新合成的p72蛋白共定位的较少。此外，作者还研究了ASFV病毒粒子、SQSTM1/p62和Ub在PAM中的共定位。如图2H所示，在ASFV感染的PAM中，在30 mpi时观察到NHS酯标记的ASFV病毒粒子、SQSTM1/p62和Ub的共定位，这表明病毒粒子上的p72可能被泛素系统泛素化和降解。总之，这些发现表明，在病毒感染的早期阶段，存在于ASFV病毒体中的p72可以被SQSTM1/p62通过其UBA结构域泛素化和识别。

图2. 衣壳蛋白p72被自噬靶向并降解

为了全面阐明p72被自噬作用靶向的机制，作者用FLAG-p72和HA-Ub质粒转染HEK293T细胞，然后进行Co-IP实验。发现过表达的p72在HEK293T细胞中多泛素化(图3A)。为了确定p72的哪个结构域是其泛素化所必需的，构建了p72的两个截断突变体(p72-ΔC和p72-ΔN)。结构域映射结果显示p72的c端结构域主要是其泛素化所必需的(图3B)。事实上，p72的c端结构域的缺失显著降低了与p62的相互作用(图3C)。综上所述，研究结果清楚地表明，SQSTM1/p62识别多泛素化的p72，主要是在p72的c端。

为了检测p72多泛素化需要哪一种E3连接酶，作者用ASFV-HLJ/18感染PAM，并使用抗p72抗体进行Co-IP检测。质谱分析(MS)结果鉴定出E3 Ub连接酶Stub1，也被命名为CHIP(12)(图3D)。Co-IP结果显示，在HEK293T细胞中，Stub1与p72相互作用(图3E)。此外，作者还研究了Stub1是否参与了p72的多泛素化和降解。如图3F所示，在HEK293T细胞中，Stub1过表达显著增强p72多泛素化，降低p72蛋白水平。与这些结果一致，作者观察到内源性Stub1在2 hpi时与p72点共定位，但不与感染后期积累在VFs中的新合成的p72共定位(图3G)。总的来说，这些发现提供了Stub1与p72相互作用并促进其泛素化和p72降解的证据。

图3.Stub1通过促进p72的多泛素化来影响p72的稳定性

先前的研究表明，E3连接酶Stub1特异性靶向泛素化蛋白聚集体进行自噬清除。为了研究Stub1如何影响p72的稳定性，作者分别用蛋白酶体和自噬溶酶体抑制剂处理共表达FLAG-p72和Myc-Stub1的HEK293T细胞。如图4A所示，自噬溶酶体抑制剂可以抑制stub1介导的p72降解，而蛋白酶体抑制剂则不能。这些结果表明，Stub1通过自噬介导p72的降解。

随后，为了研究p72泛素化是否需要E3连接酶和Stub1的伴侣结合活性，作者将FLAG-p72和Myc-Stub1突变体转染HKE293T细胞，然后通过Co-IP来评估p72的表达及其与内源性SQSTM1/p62的相互作用。如图4B所示，与Stub1-WT相比，Stub1K30A和Stub1H260Q没有促进p72的降解。此外，内源性SQSTM1/p62与p72的相互作用增加，Stub1-WT表达增加，而在表达Stub1K30A或Stub1H260Q的细胞中，相互作用和p72降解明显减弱。这些结果表明，在自噬介导的p72降解中，Stub1的H260和K30都是必不可少的。

HSPA8是参与选择性自噬的关键伴侣。Stub1已被确定为HSPA8的辅助因子，HSPA8也参与选择性自噬介导的泛素化底物降解。为了测试HSPA8是否参与了stub1介导的p72降解，作者用表达FLAG-p72和Myc-Stub1的质粒转染HEK293T细胞12小时。然后用靶向HSPA8 (siHSPA8)的小干扰RNA (siRNA)转染36小时。结果表明，敲低HSPA8的表达抑制了stub1介导的p72降解(图4C)。此外，HEK293T细胞中p72和HSPA8之间存在相互作用(图4D)，这在ASFV感染的PAM中得到了证实(图4E)。为了检测HSPA8和p72的共定位，将PAMs分别感染5个MOI的ASFV 2 h和1个MOI的ASFV 20 h，并通过共聚焦分析观察它们的共定位。在2 hpi时观察到HSPA8和抗p72标记的病毒粒子共定位，而在20 hpi时HSPA8与扩散分布的新合成p72没有明显的共定位(图4F)。在感染早期，NHS酯标记的ASFV颗粒始终与HSPA8和p72共定位(图4G)。这些结果表明HSPA8与ASFV病毒粒子表面的p72相互作用。作为HSPA8的辅助因子，Stub1促进泛素化和自噬介导的p72降解。

图4. Stub1通过HSPA8介导的自噬促进p72的降解

为了研究ASFV感染过程中导致病毒衣壳分解的初始步骤，作者首先检测了吸附或内化病毒粒子p72蛋白水平的变化。采用免疫印迹法检测p72蛋白在不同时间点的表达。如图5A所示，P72在ASFV感染的前4小时内降解，4小时后几乎检测不到。在20 hpi时，由于病毒基因组扩增，检测到新合成的P72。为了验证SQSTM1/p62是否参与ASFV感染早期p72的降解，作者用靶向SQSTM1/p62 (sip62)的siRNA转染PAM，然后感染ASFV 1小时。裂解细胞，用TCA沉淀法浓缩蛋白裂解物，检测p72的表达。如图5B所示，与转染siNC的细胞相比，转染sip62的细胞中SQSTM1/p62的内源性表达显著降低，p72的表达更高，这表明SQSTM1/p62可能参与了ASFV感染早期的剥膜过程。

为了进一步验证自噬是否参与ASFV感染过程中的衣壳分解，作者用VER-155008 (HSPA8抑制剂)和Baf A1作为阳性对照预处理PAM，然后感染ASFV (MOI = 10)。共聚焦分析观察到核心蛋白p72和p34的共定位。如图5C和D所示，与Baf A1类似，与对照细胞相比，VER-155008孵育抑制了衣壳的核壳分离。为了检验SQSTM1/p62和LAMP2是否影响ASFV病毒粒子的分解，作者用sip62或靶向LAMP2的siRNA (siLAMP2)转染PAM，然后感染ASFV。Western blotting检测SQSTM1/p62和LAMP2蛋白的表达。结果发现，转染靶向SQSTM1/p62和LAMP2的sirna后，内源性SQSTM1/p62和LAMP2的表达显著降低(图5E)，细胞活力未受到显著影响(图5F)。如图5G和H所示，敲低SQSTM1/p62或LAMP2的表达增加了ASFV感染的PAM中p72和p34共定位的比例。这些数据表明自噬参与了衣壳的分解。此外，与对照组相比，经VER-155008和Baf A1预处理的PAM中可溶性CA的表达降低，而CA核的表达增加(图5I)。将PAM分别转染sip62和siLAMP2，然后再感染ASFV (MOI = 10)，得到了类似的结果(图5J)。

随后，作者使用ISH检测和定量内化ASFV在PAM中衣壳分解后释放的病毒DNA (vDNA)。PAMs分别感染ASFV (MOI = 10) 0、15、60分钟。结果发现在感染后15分钟内没有检测到vDNA释放，但在60 mpi时检测到vDNA(图5K)。为了检测在自噬抑制剂存在下ASFV释放的vDNA是否减少，作者用VER-155008和Baf A1预处理PAM，并感染ASFV 60分钟。结果发现，在上述自噬抑制剂存在的情况下，ASFV释放的vDNA减少(图5L和M)。用sip62和siLAMP2转染PAM，然后感染ASFV(图5N和O)，也得到了类似的结果，表明阻断自噬抑制ASFV基因组释放。进一步研究HSPA8抑制对ASFV复制的影响，作者用VER-155008预处理PAM并感染ASFV 16小时。结果发现，在用VER-155008预处理的细胞中，病毒蛋白p72的表达水平在16 hpi时呈剂量依赖性降低(图5P)。此外，ASFV吸附和内化不受影响(图5Q)。

图5. 通过HSPA8介导的自噬降解p72有助于衣壳分解

这篇文章发现内化的ASFV病毒粒子在病毒感染的早期阶段进入自溶酶体。Stub1通过HSPA8介导的自噬途径促进p72泛素化和降解，为p72降解的机制提供了新的见解，并为理解ASFV感染过程中自噬参与衣壳分解提供了一个模型。

原文链接：https://pubmedhttps://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39688418/.ncbi.nlm.nih.gov/39567541/

来源： ZhaoSunLab

编辑：吃一口小猫