疫苗前沿 | 汉坦病毒疫苗研究进展

中文摘要

汉坦病毒（hantavirus，HV）感染可引起急性传染病肾综合征出血热和汉坦病毒心肺综合征，在世界各地均有流行且致死率较高，成为了全球性公共卫生问题。目前尚无针对HV的特异性治疗药物或方法，接种疫苗成为预防未来大流行的有效、经济手段。目前HV疫苗主要有灭活疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、DNA疫苗等，主要将包膜糖蛋白和核衣壳蛋白作为免疫原，诱导机体免疫系统产生体液免疫应答和细胞免疫应答清除HV感染细胞。此文对国内外各种HV疫苗及其优缺点、作用机制、研究进展等进行简要综述。

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正文

汉坦病毒（hantavirus，HV）1976年在田鼠体内首次被发现并于1978年从人类血清中被分离 ，是引起汉坦病毒心肺综合征（hantavirus cardiopulmonary syndrome，HCPS）和肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）的病原体。全球每年新增上述2类患者约20万例，其中HFRS病例90%以上在中国。HCPS与HFRS的病死率分别为30%~50%和1%~15%，已成为重大的全球性公共卫生威胁。目前仍未有针对HV的特异性药物，对感染患者多采用广谱抗病毒药物及支持性的对症治疗。HV感染是人畜共患病，鉴于其不断暴发、流行扩散趋势持续加剧且危害性较高，针对HV感染的预防措施，特别是疫苗开发对于降低疾病发病率及应对未来可能的大流行至关重要 。

目前世界范围内虽然仍无疫苗通过WHO或美国FDA的认证，但中国、韩国、美国、德国、俄罗斯等国为HV疫苗研发、疫苗保护效力和安全性提高做了大量工作，其中中国、韩国有多款疫苗已在本国临床应用多年。本文将主要对国内外抗HV相关疫苗的疫苗种类、作用机制、研究现状等方面进行概述，以期为相关疫苗的研发和制备工作提供参考。

1

生物学特征

HV属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，为球形结构，直径80~120 nm，是包膜负义单链分段RNA病毒，有双层脂质包膜。根据基因组片段核苷酸序列长度将分段基因分别命名为小 （small，S）、中（middle，M） 和大（large，L）。S片段由1 600～2 000个碱基组成，相对保守，编码核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）；NP可诱导机体产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答，可作为抗原用于HV感染的血清学诊断。M片段由3 600～3 700个碱基组成，只编码1个开放阅读框（open reading frame，ORF），表达包膜糖蛋白（glycoprotein，GP），包括Gn和Gc；Gn和Gc形成四聚体结构构成嵌入病毒脂质双层包膜的表面刺突，与细胞表面受体结合，可诱导机体产生中和抗体；GP在不同型别间变化较大，常作为HV基因型分型标准。L片段由6 300～6 500个碱基组成，含有1个ORF，编码病毒特异的RNA依赖性RNA聚合酶。2017年国际病毒分类委员会在第10次分类报告中将汉坦病毒属划分为41个种，其中22种可引起人类感染，主要包括汉滩病毒（Hantaan virus，HTNV）、首尔病毒（Seoul virus，SEOV）、普马拉病毒（Puumala virus，PUUV）、多布拉瓦病毒（Dobrava virus，DOBV）、安第斯病毒（Andes virus，ANDV）、辛诺布雷病毒（Sin Nombre virus，SNV），以及乔克罗病毒（Choclo virus，CHOV）。

2

流行病学特征

HV在啮齿动物间传播，也可通过啮齿动物的尿液、粪便、唾液以及气溶胶或通过叮咬、伤害将病毒传播给人类。其中与啮齿动物及其排泄物接触密切程度、接触频率较高的农民、林业工人及军人感染HV的风险较大，在我国以黑线姬鼠、褐家鼠以及林区的大林姬鼠为主要宿主动物和传染源。HV感染及其引起的相关疾病在世界不同地区呈地方性流行并频繁暴发（表1）。基于啮齿动物宿主的特异性和分布特征，人类感染病例往往在地理上具有明显的区域特点，并且基于啮齿动物活动特点，春秋季和夏季是病毒传染及相关疾病高发期。HV第1次大流行发生在1950—1953年朝鲜战争期间，有超过3 000名联合国军士兵确诊朝鲜出血热，第2次大流行是1993年发生在美国四角地的HCPS大暴发。在亚洲，主要以HTNV和SEOV感染为主，病毒侵入人体后主要导致发热、出血、休克和肾脏损伤，引起HFRS，病例主要集中在中国、韩国等。在我国流行的HTNV和SEOV分别称为Ⅰ型病毒和Ⅱ型病毒，其中Ⅰ型病毒引起的 HFRS病情较重，Ⅱ型病毒引起的HFRS病情相对较轻。PUUV和DOBV是欧洲主要流行的HV，可引起HFRS和流行性肾病。ANDV和SNV是以美国为主的美洲地区主要流行的HV类型，是引起HCPS的病原体，主要表现为肺毛细血管渗漏和心血管受累。

3

疫苗研究进展

HV的GP和 NP是诱导机体产生保护性免疫应答的主要结构蛋白，其中的Gn及Gc是主要的免疫原，可刺激机体产生中和抗体。相较于Gn及Gc，NP结构表面存在多个CTL表位，在诱导机体细胞免疫应答中起主要作用，可有效保护HV对细胞的破坏。根据疫苗研发路线的不同，HV疫苗主要分为灭活疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗、病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）疫苗、DNA疫苗等，分别处于不同的研发阶段（表2）。

3.1

灭活疫苗

灭活疫苗是最常见和最传统的疫苗开发方法，可以直接注射到动物或人体中诱导保护性免疫应答。灭活疫苗虽然技术路线清晰、方法成熟、应用广泛，但存在免疫原性较低、保护周期较短、诱导长期免疫和细胞介导的免疫效率较低等不足。HV灭活疫苗通过在Vero细胞系或哺乳期小鼠大脑细胞中培养分离的病毒株，然后经物理或化学手段灭活来制备的。

1981年我国首次分离获得HV后，便开启HFRS疫苗研究工作并将其纳入“八五”、“九五”科技攻关项目。中国药品生物制品检定所联合上海生物制品研究所、兰州生物制品研究所、长春生物制品研究所、浙江省防疫站（现浙江省CDC）、杭州天元生物药业有限公司研发了沙鼠肾细胞I型灭活疫苗、乳鼠脑纯化I型灭活疫苗、地鼠肾细胞Ⅱ型灭活疫苗。虽然这3种单价灭活疫苗的安全性、中和抗体等血清学指标以及免疫效果均经过大规模临床试验验证，但限于当时技术水平及制作工艺等因素仍存在疫苗纯化程度不足、中和抗体水平较低等问题。随后，中国CDC病毒病预防控制所、沈阳百奥生物技术有限责任公司、长春生物制品研究所、兰州生物制品研究所、浙江省CDC、杭州天元生物药业有限公司等开展了以沙鼠肾细胞、地鼠肾细胞、Vero细胞为基质的双价纯化灭活疫苗的研究。1994年中国研制出针对SEOV和HTNV感染的双价灭活疫苗，该疫苗于2003年获批使用并获得国家扩展免疫规划支持。临床试验证明能诱导良好的免疫应答，产生高滴度抗体，形成有效保护，且异常接种反应发生率低，安全性良好。疫苗接种推广后全国HFRS病例数也由2000年的 37 814 例减少到2007年的11 248例，致死率由3%降至1%左右。Li等研究表明，接种纯化HTNV（Ⅰ型）和SEOV（Ⅱ型）双价灭活疫苗后，接种者血清中HTNV-NP特异性IgM、IgG抗体以及中和抗体的水平在接种1个月后显著升高，且IgM、IgG抗体滴度与中和抗体滴度呈正相关；HTNV-NP特异性IgG和中和抗体的阳性率和水平分别在接种后3个月达到最高值，并可持续至接种后33个月。此外有研究表明在接种国产灭活纯化双价疫苗3剂次后机体产生的有效中和抗体滴度会持续2~3年。

1990年，福尔马林灭活疫苗Hantavax成为韩国第1款开发成功并进入临床应用的HV疫苗，该疫苗通过使用ROK 84/105型HTNV毒株在哺乳期小鼠大脑中繁殖，随后分离获得小鼠大脑细胞并对其进行灭活处理而获得。虽然临床试验证明该疫苗安全性良好，不良反应发生率较低，并成功地降低了HV感染的发生率及HFRS的发病率，住院HFRS 患者总数从1991年的1 234例下降到1997年的415例；但在2剂次接种后中和抗体应答较差，有效抗体滴度持续时间较短，利用3剂或4剂方案加强免疫后才可在宿主体内获得持续 3~4 年的保护性免疫应答。

3.2

亚单位疫苗

亚单位疫苗安全、易于生产，而且多价制剂不同成分之间不易形成干扰，但免疫原性相对较差。HV亚单位疫苗使用Gc、Gn或NP构建，这些蛋白具有高免疫原性，具有诱导免疫系统产生抗HV抗体的能力。利用杆状病毒和重组牛痘病毒表达的Gc或Gn，在仓鼠HV感染性攻击模型中可诱导保护性免疫应答。由于NP在不同类型HV中较为保守，因此可诱导各表达系统产生针对PUUV、DOBV和ANDV NP的高度交叉应答。与仅表达Gc或Gn的亚单位疫苗相比，Gc/Gn联合使用或与NP联合免疫可诱导更高滴度抗体应答，提供抗体种类更全面、中和抗体滴度更高的完全保护，仅表达NP的杆状病毒重组蛋白也可以保护实验动物免受HV感染攻击。此外，佐剂可通过免疫调节、抗原呈递优化、T细胞诱导提供可靠的免疫应答，同时减少免疫次数、增加免疫的强度和持续时间，并协调Th1和Th2免疫应答，有效增强HV疫苗在人体中的免疫原性和保护效力。

3.3

病毒载体疫苗

病毒载体疫苗具有免疫效果好、稳定性高、诱导位点专一等优点，是目前疫苗研发领域的重要发展方向，但对免疫缺陷个体存在免疫危害风险及重复接种限制。Schmaljohn等将HTNV S和M段cDNA插入痘苗病毒（vaccinia virus，VACV）构建了双重组嵌合疫苗，接种2剂VACV载体HTNV重组疫苗的叙利亚仓鼠可免受HTNV或SEOV感染，但不能免受PUUV感染。McClain等进行的临床试验中该疫苗的安全性得到证实，在72%的VACV重组疫苗初次接种志愿者体内检测到抗HTNV中和抗体，第2次接种后抗VACV和抗HTNV中和抗体滴度均明显增加，并且皮下接种的疫苗免疫效果优于疤痕接种。Safronetz等将ANDV编码N、G的基因片段插入到非复制性腺病毒基因组获得腺病毒载体疫苗，将该疫苗接种小鼠后可引起强烈的CTL应答，并且在仓鼠受到致死剂量的ANDV攻击时具有保护作用。

Lee等将融合了HTNV Gn和Gc的非复制水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）重组疫苗VSVdeltaG*HTN颗粒对小鼠进行2剂次免疫后，利用ELISA和中和试验检测到小鼠体内产生了抗GP抗体；对小鼠进行3次免疫可对HTNV攻击产生保护作用。Prescott等利用ANDV糖蛋白前体（glycoprotein precursor，GPC）融合VSV构建的载体疫苗VSVΔG-ANDV-GPC可有效降低仓鼠模型单次ANDV致死剂量攻击后的死亡率，接种疫苗4周后，仓鼠产生了强大的中和抗体应答，可保护其免受ANDV攻击，并且单剂重组疫苗在接种后6个月仍可显著降低ANDV致死率。

3.4

VLP疫苗

VLP疫苗具有安全性高、免疫原性强、稳定性好等优点，目前已有HBV、HPV等VLP疫苗获批上市，但在VLP组装、插入抗原表位大小及表达系统选择上仍存在难点。HV的VLP是使用M和S片段或仅M片段构建的，该片段在体外形成类似于HV粒子的VLP。

Dong等使用HTNV M片段和可刺激免疫细胞活化的CD40配体（CD40 ligand，CD40L）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）构建了融合VLP，并与嵌入HTNV S片段的载体共转染到二氢叶酸还原酶缺陷的中国仓鼠卵巢细胞中构建重组HTNV CD40L/GM-CSF VLP。免疫小鼠后检测到抗HTNV结合抗体和中和抗体水平增高，被病毒感染器官的病毒载量也明显降低，在2次免疫6个月后小鼠中和抗体滴度明显升高，疫苗同时提高了小鼠体内IFN-γ、IL-2水平，增强了CTL活性，诱导了更高水平的HTNV特异性细胞免疫应答。Cheng等将CD40L/GM-CSF修饰的HTNV VLP皮下注射接种C57BL/6小鼠，使用间接ELISA测定抗HTNV结合抗体滴度，酶联免疫斑点试验测定接种后反应T细胞分泌的IFN-γ、IL-2等细胞因子，结果显示该VLP免疫小鼠的中和抗体几何平均滴度分别为134.5和113.1，高于未修饰HTNV VLP免疫小鼠的中和抗体几何平均滴度（33.6）。同时HTNV VLP-CD40L和HTNV VLP-GM-CSF 组的表达IFN-γ、IL-2细胞数量高于未修饰的VLP及灭活HTNV疫苗组，且HTNV VLP-CD40L 组中观察到的数量最高。

HBV核心颗粒可显著提高表面呈现的外来蛋白质片段的免疫原性，其主要免疫显性区域可耐受大尺寸基因片段插入，已成为VLP疫苗载体的研究热点。HBV核心颗粒可耐受源自PUUV、HTNV或DOBV长达120个氨基酸的NP，而且已经存在的核心颗粒特异性抗体并不影响针对NP特异性免疫应答的诱导。此外，HBV核心颗粒C/E1内部区域可以同时插入2个高毒性的源自HTNV和PUUV NP或HTNV和DOBV NP片段，而不会消除HBV核心颗粒的自组装及颗粒形成能力。用嵌合DOBV、HTNV或PUUV NP氨基末端片段的HBV核心颗粒VLP疫苗接种2种不同单倍型的小鼠品系，可诱导高滴度和交叉反应的NP特异性抗体应答。该疫苗有或没有佐剂都可以刺激所有类别IgG抗体的产生，表明HBV核心颗粒有效提高了NP的免疫原性，诱导、加强了免疫应答，增强了疫苗的抗病毒效果。

3.5

核酸疫苗

与其他类型疫苗相比，DNA疫苗免疫记忆特征更强，更易产生长期免疫；有复制缺陷，不能恢复毒力，不能在人与人之间或环境之间传播，更安全；不影响载体原有的免疫特性，不存在无关的病毒抗原。目前DNA疫苗是HFRS和HCPS疫苗研究中最流行的方法，针对HV开发的DNA疫苗大都利用表达系统生产重组靶向表达HV M基因编码的Gn和Gc，众多研究也表明，HTNV、SEOV、PUUV、SNV和ANDV等DNA疫苗是目前被认为最具开发前景的疫苗。

Jiang等构建了DNA疫苗pVAX-LAMP/Gn，是编码HTNV Gn和溶酶体相关膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein 1，LAMP1）的重组DNA疫苗。LAMP1将外源性抗原加工途径改变为MHCⅡ，可有效激发CD4 + T细胞应答，增强体液和细胞介导的免疫应答，可改善目前使用的灭活疫苗所缺乏的免疫记忆。小鼠在首次接种疫苗后4个月免受HTNV攻击，接种3剂疫苗后小鼠免疫应答维持6个月；疫苗接种BALB/c小鼠后通过ELISA、中和试验检测小鼠体内特异性抗Gn抗体和中和抗体，pVAX-LAMP/Gn组中和抗体滴度为1∶51，高于pVAX-Gn组1∶36及灭活疫苗组的1∶24；pVAX-LAMP/Gn组特异性抗体滴度为1∶800，明显高于pVAX-Gn组1∶159；利用酶联免疫斑点试验检测小鼠体内IFN-γ和CTL活性，结果表明pVAX-LAMP/Gn较其他对照组疫苗细胞免疫保护作用更强。

Kamrud等将SEOV M基因片段分别靶向克隆至裸DNA质粒表达载体pWRG7077、基于DNA的Sindbis复制子载体（pSIN2.5）和修饰的Sindbis复制子载体（pSINrep5），构建了3种DNA疫苗。通过基因枪接种到叙利亚小鼠体内，结果显示3种疫苗均产生抗SEOV免疫应答。在叙利亚仓鼠中进行的初步研究表明，与 SEOV S片段相比，SEOV M片段的保护作用更强，证明了选择M基因作为靶基因的免疫特征优越性。研究者基于以上研究开发了针对HTNV M片段的DNA疫苗，仓鼠接种该疫苗对HTNV、SEOV和DOBV感染均具有保护作用，非人灵长类动物接种该疫苗产生了强大的中和抗体应答，此研究为后续PUUV、ANDV和SNV M片段DNA疫苗的开发奠定了基础。PUUV DNA疫苗可在仓鼠和非人灵长类动物中产生高滴度的中和抗体并保护仓鼠免受PUUV和ANDV感染，但不能保护仓鼠免受其他HFRS相关HV的感染。ANDV和SNV DNA疫苗分别在恒河猴和兔子体内产生了高滴度的中和抗体。

多种给药途径研究发现，基因枪接种比皮下注射等其他途径更有效，此外，探索肌内电穿孔递送能否增强疫苗免疫原性、提高免疫效果的研究也正在进行临床试验。HV的不同DNA疫苗的组合比单一疫苗给药能更有效地引起免疫应答，Perley等研究表明单独接种HTNV、PUUV DNA疫苗的受试者中分别有30%、44%产生了中和抗体，而在接种联合疫苗的受试者中56%产生了针对1种或2种病毒的中和抗体。

4

展望

考虑到HV不断扩大的流行趋势及相关传染病的生态流行病学高度复杂性、全球性影响、高致死率，以及相较治疗性药物研发难度大、成本高、周期长，且存在病毒变异等不确定风险，预防及治疗性疫苗研发技术更加成熟、研发路线更加清晰、远期成本更低，开发相关的保护性疫苗势在必行。HV疫苗主要利用结构蛋白Gn、Gc作为免疫原诱导体液免疫应答产生中和抗体，或借助免疫原性更强结构表面存在更多CTL表位的NP诱导细胞免疫应答，从而保护宿主细胞免受HV的侵袭。目前世界范围内已有灭活疫苗、病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、VLP疫苗、DNA疫苗等多技术路线疫苗处于疫苗构建、动物模型建立、动物实验等临床前研究阶段或I、II期临床试验以及区域内临床应用阶段，其安全性及有效性都得到了一定的证实。虽然目前在研HV疫苗种类及数量较多，但其开发仍受到了诸多因素的阻碍，例如对病毒感染、致病机制、免疫逃逸机制、流行病学特点等缺乏足够深入的研究，缺乏体现疾病关键病理过程的动物模型，对病毒免疫病理学和保护性免疫机制了解有限；已进入临床应用的疫苗虽然被认为是安全的，但评估其疗效的研究却较少。此外，是否进行联合免疫以及联合免疫组合模式的选择，是否使用免疫佐剂及免疫佐剂类型的选择以及皮下注射、基因枪、肌内电穿孔等疫苗递送方式的选择，实验动物模型的选择等可能影响疫苗免疫原性、免疫效果及效果评价的问题仍需进一步深入研究。相信随着对HV及其致病机制研究的不断深入，现代病毒学、分子生物学、免疫学等学科的不断发展以及基因工程等实验技术的不断进步，HV疫苗将不断完善并最终造福人类。

作者

裴杰1 邢伟1 段青2 穆鹏3

1威海市中心医院中心实验研究室， 威海 264400；2山东省疾病预防控制中心传染病防制所， 济南 250014；3山东文登整骨医院检验科， 威海 264400

通信作者：穆鹏，

Email：sdwhzgmp@163.com

引用本文：裴杰, 邢伟, 段青, 等.汉坦病毒疫苗研究进展[J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(4): 230-237.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240218-00008

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撰写| 国际生物制品学杂志

校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea

编辑 设计| Alice