FSHW | 桦木酸通过抑制p38磷酸化缓解F-2毒素诱导的小鼠卵巢氧化损伤与炎症反应

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Highlights

• 桦木酸缓解F-2毒素诱导的小鼠卵巢氧化应激和炎症反应

• 桦木酸抑制F-2毒素引起的卵巢生殖激素分泌障碍

• 桦木酸下 调p38磷酸化降低F-2毒素诱导的卵巢损伤

Introduction

镰刀菌毒素作为镰刀菌属真菌产生的多种有毒代谢产物，在发霉的玉米、小麦、大米等谷物中含量极高，不仅引起农作物产量和品质下降，造成巨大的食品安全隐患和经济损失，还严重危害动物与人类的健康。F-2毒素又称玉米赤霉烯酮，是一种镰刀菌非甾体雌激素类真菌毒素，因其化学结构与天然雌激素相似，能竞争性地与雌激素受体（ER）结合，导致机体生殖功能障碍。F-2毒素的生殖毒性主要与氧化应激有关。研究证实F-2毒素引起哺乳动物卵巢颗粒细胞活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的蓄积，激活氧化应激信号通路，诱导DNA损伤与细胞凋亡，从而导致卵巢损伤。F-2毒素还能通过增加编码肿瘤坏死因子（TNF）信号通路的基因表达，诱导颗粒细胞凋亡，严重时会导致机体卵巢癌的发生。这些发现揭示了F-2毒素引发的氧化应激严重损害了雌性生殖健康。F-2毒素中毒没有特效解毒剂，但植物源性抗氧化剂具有多靶点、多机制及多环节的作用特点，能有效缓解机体氧化应激和炎症反应，而且副作用较小，这使得植物源抗氧化剂成为缓解霉菌毒素中毒的潜在研究方向。

桦木酸（BA）是一种植物源性的五环三萜类化合物，广泛存在于食品、药材和其他植物中，如白桦树的树皮和酸枣果实等。BA具有广泛的药理活性，如抗炎、抗氧化应激、抗病毒和抗肿瘤等。研究发现，BA通过增加抗氧化酶活性、抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路和激活细胞核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路，保护小鼠胸腺和脾脏免受T-2毒素引起的氧化损伤。另一项研究也证实，BA抑制ERα mRNA和蛋白质水平，从而表现抗雌激素的作用。此外，BA还通过抑制ERβ信号通路和减少促炎因子水平来缓解子宫内膜异位症。然而，BA对F-2毒素诱发的卵巢损伤是否具有良好的保护作用尚未见报道。因此，湖南农业大学动物医学院孔丽、高鑫禹、袁志航副教授、易金娥教授等在本研究中旨在探索BA对F-2毒素诱导卵巢损伤的保护作用及其潜在机制，为缓解F-2毒素引起的雌性生殖毒性提供调节靶点，探索BA在生殖调节和药物干预中的可行性，为天然产物药物的使用开辟新途径，为食品污染物的解毒提供新方法。

Results and Discussion

BA对F-2毒素诱导的小鼠卵巢损伤的保护作用

为了研究BA对F-2毒素诱导的卵巢损伤的影响，对卵巢进行了H&E染色和超微结构观察。如图1A所示，与对照组相比，F-2毒素组卵巢炎性细胞浸润且伴有严重充血、生长卵泡和黄体的数量显著减少。然而，F-2毒素诱导的卵巢损伤在BA或维生素E（VE，阳性对照）的干预下显著改善。同时，观察卵巢的超微结构发现，相比于对照组，F-2毒素组卵巢颗粒细胞出现排列紊乱、线粒体肿胀和嵴断裂、内质网扩张，而BA治疗显著逆转了F-2毒素诱导的卵巢颗粒细胞超微结构的病理变化（图1B）。说明BA和VE治疗可显著改善卵巢形态学病理变化，从而有效保护F-2毒素诱导的卵巢损伤。

BA对F-2毒素诱导的生殖激素分泌障碍的调节作用

为了探讨BA对F-2毒素引起的生殖激素分泌紊乱的调节作用，检测了小鼠血清中生殖激素水平和卵巢ER蛋白表达。与对照组相比，F-2毒素显著降低了血清中卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）的水平，0.5 mg/kg BA单独组降低了FSH的水平，而0.25 mg/kg BA治疗逆转了这一现象。此外，VE明显缓解了F-2毒素诱导的LH水平降低（图2A和B）。随后，根据免疫组织化学和western blot分析结果发现，BA或VE处理抑制了F-2毒素诱导的卵巢组织中ERα和ERβ蛋白表达的增加。然而，相比于对照组，在0.5 mg/kg BA单独组中观察到ERβ蛋白表达被抑制（图2C-G）。以上结果表明，BA有效缓解了F-2毒素引起的小鼠生殖激素分泌障碍。

BA改善小鼠F-2毒素诱导的氧化应激

在正常生理条件下，ROS在卵泡发生、卵母细胞成熟、子宫内膜周期和黄体溶解过程中发挥着重要的调节作用，与生殖功能密切相关。病理情况下，ROS的过度积累会导致氧化应激，从而引起卵巢损伤。接下来检测了卵巢和血清中氧化还原系统的相关参数，以评估BA是否能缓解F-2毒素引起的卵巢氧化损伤。结果发现，与对照组相比，F-2毒素显著升高了卵巢中的ROS、MDA和过氧化氢酶（CAT）水平（P＜0.05和P＜0.01），并抑制了超氧化物歧化酶（SOD）活性（P＞0.05），BA或VE处理逆转了F-2毒素的损害作用（图3A-E）。此外，F-2毒素导致血清中MDA、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平显著升高，BA或VE处理后，逆转了MDA、CAT和GSH-Px水平。同时，0.5 mg/kg BA治疗增加了血清中的SOD活性（图3F-I）。有趣的是，与对照组相比，0.5 mg/kg BA单独组显示卵巢中的CAT水平和血清中的MDA水平明显降低，但血清中的SOD和GSH-Px水平显著升高（图3D，F，H和I）。结果显示，BA减少了ROS和MDA蓄积，维持机体氧化还原稳态，从而缓解了F-2毒素诱导的卵巢损伤。

BA对F-2毒素诱导的卵巢炎性细胞因子mRNA表达的影响

氧化应激诱导炎症反应。接下来，探索了BA是否可以调节F-2毒素诱导的卵巢中炎性细胞因子mRNA表达（图4A-D）。结果发现，与对照组相比，F-2毒素显著增加了TNF-α、白介素6（IL-6）、IL-1β和IL-10的水平，而0.25 mg/kg BA或VE治疗抑制了炎性细胞因子的升高。然而，用0.5 mg/kg BA治疗显著促进F-2毒素诱导的IL-6和IL-1β水平的升高。此外，与对照组相比，0.5 mg/kg BA单独组显著降低TNF-α和IL-10的mRNA表达。总而言之，0.25 mg/kg BA或VE可以通过抑制促炎细胞因子mRNA表达来改善F-2毒素诱导的卵巢炎症反应。

图4 BA对F-2毒素诱导的卵巢炎症细胞因子mRNA表达的影响

BA对F-2毒素诱导的卵巢MAPK/Nrf2信号通路相关蛋白表达的影响

为探索BA改善F-2毒素诱导的卵巢氧化应激和炎症是否与MAPK/Nrf2信号通路密切相关，用western blot分析MAPK/Nrf2信号通路相关蛋白表达。结果表明，与F-2毒素组相比，0.25 mg/kg BA或VE处理显著降低了p-p38/p38的比率（P＜0.05），但对p-ERK/ERK和p-JNK/JNK的比率无显著影响（图5A-D）。此外，与对照组相比，F-2毒素不仅抑制了Nrf2蛋白的表达（P＞0.05），而且显著降低了HO-1蛋白的表达（P＜0.01）。相反，在0.5 mg/kg BA单独组和VE治疗组中，Nrf2蛋白表达显著增强（图5E-H）。综上所述，0.25 mg/kg BA可以显著下调p38磷酸化，从而抑制F-2毒素诱导的卵巢氧化损伤和炎症反应。

图5 BA对F-2毒素诱导的卵巢中MAPK/Nrf2信号通路相关蛋白表达的影响

Conclusion

本研究证明BA对F-2毒素诱导的卵巢损伤具有保护作用。该保护作用主要通过抑制p38磷酸化，发挥抗氧化和抗炎能力来实现。这些结果为BA治疗F-2毒素引起的卵巢损伤提供了理论基础，也为真菌毒素性食物污染提供了新的解毒方案。

第一作者

孔丽，女，兽医学博士。主要从事动物保健与营养代谢的研究。近年来，先后参加国家自然科学基金、湖南省自然科学基金，湖南省重点研发计划，湖南省发展与改革委员会创新研发项目等研究课题；目前主持湖南省研究生科研创新项目和湖南农业大学研究生科研创新项目1 项；发表学术论文10 篇，其中以第一作者发表SCI论文2 篇。

通信作者

易金娥，女，湖南农业大学动物医学院教授，博士生导师，畜禽保健湖南省工程研究中心主任，兽医学硕士学位点领衔人。第十三届全国高等院校霍英东青年教师奖获得者，湖南省青年骨干教师培养对象，湖南省优秀硕士论文指导教师，湖南省优秀教学能手。中国畜牧兽医学会动物毒物学分会常务理事，兽医内科与临床诊疗学分会常务理事。Journal of Agricultural and Food Chemistry, Food Research International, Food & Function, Food Bioscience, Phytomedicine, International Immunopharmacology, Journal of functional foods, Molecular Neurobiology, Oxidative Medicine and Cellular Longevity 等多个期刊审稿人。主要从事动物保健与营养代谢的研究。近年来，先后主持国家自然科学基金、教育部高校博士点教师基金，湖南省重点研发计划，湖南省自然科学基金，湖南省发展与改革委员会创新平台建设项目，湖南省发展与改革委员会创新研发项目，湖南省教育厅重点项目等科研课题，发表学术论文100余篇，其中SCI论文近50篇，授权国家发明专利5 项。

Betulinic acid protects against ovarian impairment by decreasing F-2 toxin-induced oxidative stress and inflammation associated with the downregulation of p38 expression in mice

Li Kong1, Xinyu Gao1, Lijuan Zhu, Xing Lin, You Huang, Chunlin Huang, Wenjiang Yang, Yazhi Chen, Haoqiang Zhao, Jing Wu, Zhihang Yuan*, Jin’e Yi*

Hunan Engineering Research Center of Livestock and Poultry Health Care, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

F-2 toxin is an estrogenic mycotoxin that causes reproductive disorders in animals. Betulinic acid (BA) is a natural pentacyclic lupane-structure triterpenoid that has diverse pharmacological activities. In this study, the antioxidative and anti-inflammatory effects of BA and its underlying mechanism are explored in F-2 toxin-triggered mouse ovarian damage. We found that BA alleviated the F-2 toxin-induced ovarian impairment by stimulating follicle growth, reducing inflammatory cell infiltration, repairing damaged mitochondria and endoplasmic reticulum. Simultaneously, BA not only reversed F-2 toxin-induced reduction of follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) levels in the serum, but also restrained the protein expression of the estrogen receptors α (ERα) and ERβ. Moreover, BA restored the balance of F-2 toxin-induced ovarian redox system disorders. Subsequently, we found that 0.25 mg/kg BA played an anti-inflammatory role in the F-2 toxin-induced ovarian impairment by decreasing interleukin-1β (IL-1β), IL-6, and tumor necrosis factor-α (TNF-α) mRNA expression, as well as inhibiting p38 protein expression.These data demonstrated that BA exerts its protective effect on F-2 toxin-induced ovarian oxidative impairment and inflammation by inhibiting p38 expression, which implies a natural product-based medicine to ameliorate F-2 toxin-caused female reproductive toxicity and provides a detoxifying method for food contaminated by mycotoxin.

Reference:

KONG L, GAO X Y, ZHU L J, et al. Betulinic acid protects against ovarian impairment by decreasing F-2 toxin-induced oxidative stress and inflammation associated with the downregulation of p38 expression in mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(3): 1292-1302. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250108.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

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