Protein & Cell | 邵峰实验室揭示Caspase-2介导的细胞死亡之谜：从内源性PIDDosome激活到化学调控

Caspases是一类在程序性细胞死亡中扮演关键角色的高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族。哺乳动物的caspases可分为两大类：凋亡性和炎症性caspases。凋亡性caspases进一步细分为启动型和效应型caspases。启动型caspases包括caspase-8和caspase-9，分别介导外源性和内源性凋亡途径。caspase-8通过被死亡诱导信号复合物（DISC）招募和激活，而caspase-9则通过线粒体破坏释放的细胞色素c诱导，并由Apaf-1组装成的凋亡体所激活。这两个启动型caspases直接切割激活下游的效应型caspase-3和-7，导致细胞凋亡。

Caspase-2是半胱天冬酶家族中高度保守的成员，由于其N端的半胱天冬酶募集结构域（CARD）而被认为是一种典型的启动型半胱天冬酶，然而caspase-2在细胞凋亡中的作用并不明确。Caspase-2缺失的小鼠能够正常存活与发育，其体内的细胞也能够发生正常的凋亡。这表明caspase-2可能不是细胞凋亡所必需的，或者在其缺失时存在其他代偿的机制。我们需要进一步的研究去全面了解并明确caspase-2在细胞凋亡中的作用和具体的分子机制。

2024年4月27日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院邵峰团队在Protein & Cell杂志在线发表题为"Dissecting caspase-2-mediated cell death: from intrinsic PIDDosome activation to chemical modulation"的研究论文，证明了由PIDDosome激活的caspase-2可以直接切割BID分子，激活下游的线粒体内源凋亡通路。此外，在化合物筛选中发现了caspase-2的小分子激动剂HUHS015，并揭示了其直接激活caspase-2的关键作用位点。

已有研究提出在遗传毒性压力的诱导下，三元复合物PIDDosome的形成可以激活caspase-2。PIDDosome，由PIDD1、RAIDD和caspase-2三种分子组成。PIDD1是一个p53诱导表达的基因，可以促进凋亡发生。RAIDD是一个同时具有DD结构域和CARD结构域的分子，其N-末端的DD与PIDD1的DD相互作用，而其C-末端的CARD通过同源CARD-CARD相互作用进而激活caspase-2。研究人员首先发现，RAIDD和caspase-2在NCI-60大部分细胞系中广泛表达，而PIDD1分子表达量则较为有限。在RAIDD和caspase-2表达量较高的细胞系中，利用Tet调控表达系统诱导表达PIDD1-CC，通过PIDDosome激活caspase-2，发现在Jurkat和HL-60这两株细胞中发生了强烈的细胞凋亡。这项发现首次明确了PIDDosome激活caspase-2可以诱导细胞凋亡。接下来，利用CRISPR全基因组遗传筛选的方法证明，由PIDDosome激活的caspase-2可以高效地直接切割BID，其切割位点和caspase-8完全一致，发生在第60位天冬氨酸残基（D60）。

接着利用化合物筛选，作者成功地找到了caspase-2的小分子激动剂HUHS015。首先通过BID的敲除验证，确认了HUHS015诱导的细胞凋亡也是通过下游的BID分子。为了更好地研究HUHS015激活caspase-2的精确分子机制，我们进行了大量的构效关系的研究，进一步优化得到了EC50约60 nM的衍生物HUHS015-36。同样是利用全基因组筛选以及PIDD1/RAIDD基因的敲除验证确认了，HUHS015通过caspase-2-BID信号通路引发细胞凋亡，不依赖于PIDDosome。

人和小鼠的 caspase-2 具有比较高的序列同源性，因此，推测 HUHS015可能能够同时激活人和小鼠的 caspase-2。意外的是，实验结果证明HUHS015 只能特异性地激活人的 caspase-2，不能激活小鼠的 caspase-2。进一步通过序列同源性分析，以及突变的细胞生化实验验证，证明了位于人的caspase-2第150位亮氨酸残基（L）和第151位酪氨酸残基（Y）是HUHS015激活caspase-2的关键作用位点。小分子直接作用于位于CARD结构域之后结构功能未知的肽链，从而引起CARD构象状态的改变，进而激活caspase-2，该发现首次揭示了一种新型的启动型caspase激活机制。

本研究通过在Jurkat和HL-60细胞中条件性表达PIDD1-CC，诱导PIDDosome形成激活caspase-2，细胞发生明显的凋亡。通过无偏倚的全基因组遗传筛选，确定了Bcl2家族蛋白中的BID分子在PIDDosome诱导caspase-2激活的细胞凋亡中的关键作用。此外，在化学筛选中发现的小分子HUHS015，可以特异性激活caspase-2介导的细胞凋亡。HUHS015系列化合物作为caspase-2的激动剂，直接靶向caspase-2的CARD结构域后的功能未知序列，其中L150Y151被确定为关键作用位点。这项发现颠覆了传统认知，即启动型caspase利用N-末端CARD结构域来感知上游的激活信号的观点。人和小鼠的caspase-2有两个关键残基的差异，使得HUHS015只能特异性地作用于人的caspase-2。在caspase-2人源化小鼠上，我们可以利用HUHS015系列衍生物研究caspase-2在重要生理和病理过程中的功能。研究还发现，在许多人类癌细胞中广泛表达caspase-2，这使得利用HUHS015系列化合物激活caspase-2介导的细胞死亡成为一种可能的治疗癌症的策略。此外，研究报道CASP2，RAIDD和PIDD1中的双等位基因致病突变与无脑回畸形（LIS）相关，小分子激动剂的发现也为此类caspase-2相关疾病的小分子药物的开发提供了新的思路。

邵峰实验室的博士生曾梦雪为本文第一作者，论文的其他作者还包括邵峰实验室的王坤博士，齐湘兵实验室的吴青翠和齐湘兵博士，生物物理研究所的丁璟珒博士，中山大学肿瘤防治中心的谢丹博士。邵峰博士为本文的通讯作者；该研究得到科技部、中国科学院战略先导科技专项、基金委、中国医学科学院、国家自然科学基金和腾讯新基石等项目支持。