展/苏文静等揭示蛋白激酶ARAF的新功能及其在肿瘤耐药中的机制

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RAS-RAF-MAPK通路作为经典的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，是多种膜受体传导的生长信号跨膜传递的交汇点。在生长因子等细胞外信号的刺激下，该通路被激活，并通过三级激酶级联的形式将生长信号进行细胞内传导，最终通过调控相关基因的转录和表达，参与细胞的增值、分化、凋亡、炎症反应等多种生理过程【1,2】。处于持续激活状态下的RAS-RAF-MAPK通路通常会造成细胞增殖或分化异常，因此，该通路中各成员蛋白的突变和异常表达与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关【3】。

生理环境下，细胞中具有GTPase活性的小G蛋白RAS被上游的受体酪氨酸激酶（RTK）等细胞表面受体激活，在鸟苷酸交换因子（GEF）的参与下，其构象从GDP结合的非活化状态变为GTP结合的活化状态。活化后的RAS通过与RAF蛋白结合促使其发生二聚化从而激活其蛋白激酶活性。活化的RAF能磷酸化下游的MEK蛋白激酶而促使其激活，并通过MEK进一步磷酸化并激活其下游的ERK蛋白。活化的ERK进入细胞核，对转录因子等一系列底物进行磷酸化修饰以改变相关基因的表达，引起细胞周期进展及细胞增殖、分化等细胞行为的改变。正因为MAPK通路如此重要的生理功能，在正常细胞中，它的激活受到非常严格的调控。例如，GTPase活化蛋白（GAP）NF1等通过促进RAS蛋白的酶活性，加速催化GTP水解为GDP，从而关闭RAS通路。而被激活的下游基因如DUSPs和Sprouty家族蛋白等也能通过不同层级的负反馈抑制来控制MAPK通路的激活水平和持续时间【4】。

作为RAF蛋白家族中三个成员之一（ARAF，BRAF，CRAF），BRAF是RAS下游突变率最高的基因，大约7~10%的肿瘤中都检测到BRAF突变，如黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌等【5】。绝大多数的BRAF突变能够不依赖RAS，以单体或二聚体方式持续激活MAPK信号，而被激活的MAPK通路通过上调靶基因表达对上游的RAS活性形成负反馈抑制作用，因此，这些细胞中的RAS活性往往非常低【6,7】。相比于BRAF突变的高发，ARAF和CRAF突变则非常稀有。尽管有部分激活型突变在肺癌、黑色素瘤、血液肿瘤中被报道【8-10】，但其突变热点与BRAF突变截然不同，目前仍缺乏对其具体激活机制的研究，同时也缺乏对RAS活性调控的进一步观察。这一现象也提示A-，B-，C-RAF的功能可能并不完全相同。

2022年5月，纪念斯隆凯特琳癌症中心Neal Rosen课题组在Molecular Cell杂志上发表了题为ARAF protein kinase activates RAS by antagonizing its binding to RASGAP NF1的论文。文章通过对ARAF S214位热点突变进行功能分析发现【8,9】，这些突变体通过形成不依赖于RAS活性的持续激活二聚体来促进MEK磷酸化。这一作用方式与BRAF II型突变非常相似，然而不同的是ARAF 214位突变在激活ERK通路后并没有产生对RAS活性的负反馈抑制，相反，部分突变过表达后反而能上调RAS-GTP水平，而CRAF对应位点突变并没有表现出相同的表型。这一反常现象提示ARAF可能具有与BRAF和CRAF不同的功能。因此，通过对野生型ARAF的功能分析发现其可以通过与RAS直接结合的方式激活RAS。进一步研究发现当ARAF与RAS结合后能够竞争性抑制GAP蛋白NF1与RAS结合，从而干扰了GAP蛋白对RAS的负调控作用，且这一功能不依赖于其激酶活性。这一发现揭示了ARAF作为RAS下游效应分子能够反向调控RAS活性的功能，并提示了ARAF在进化过程中可能作为一个调节型RAF激酶存在。

ARAF对RAS活性的直接调控意味着在ARAF高表达的细胞中RAS-GTP的本底水平更高，这一功能具有重要的生物学意义。1）在正常发育过程中，细胞的分化受MAPK通路活性的调控。当细胞受到生长因子刺激时，通过RTK活化RAS并激活MAPK通路，被激活后的ERK通过调控下游基因表达对上游通路形成负反馈抑制，从而控制信号的强度和持续时长。已有的研究结果显示ERK激活持续时间长短是控制细胞分化的重要因素【11】，而ARAF能通过维持高水平RAS-GTP来影响ERK激活程度，因此改变ARAF表达可能影响细胞分化。文章中，作者使用PC12细胞的体外分化系统对这一猜测进行了验证：正常情况下，EGF刺激造成ERK瞬时激活从而促进PC12细胞增殖，而NGF却能引起ERK长时激活进而导致细胞发生神经样分化；通过改变ARAF表达水平后作者发现，在EGF处理下，ARAF过表达能够导致PC12细胞分化而非增殖。这提示ARAF的表达水平是控制细胞命运的一个重要因素。2）在肿瘤中，ARAF高表达所引起的RAS激活则可能与耐药相关。通过分析大量肿瘤病人基因突变数据发现，在非小细胞肺癌中，ARAF基因扩增与EGFR突变型患者对TKI治疗产生耐药性具有高度相关性。作者利用人源肿瘤异种移植模型及类器官体培养等手段进一步证实了ARAF基因扩增引起的RAS活性上升是导致EGFR突变型非小细胞肺癌产生获得性耐药的一种重要机制，并且通过引入蛋白络氨酸磷酸酶SHP2抑制剂和EGFR-TKI抑制剂联合治疗的方法成功克服了耐药性问题。

综上，该研究工作揭示了蛋白激酶ARAF的新功能并解析了其在癌细胞获得性耐药产生中的作用机制，为克服肿瘤耐药提供了新的靶点和治疗思路，有利于癌症个体化精准治疗的发展。

论文通讯作者Neal Rosen及姚展博士长期从事肿瘤药理研究。第一作者苏文静博士现任浙江大学生命科学研究院研究员，课题组主要研究方向为肿瘤转移与耐药，欢迎有分子细胞生物学背景的研究人员联系申请博士后岗位，详情请见：

http://lsi.zju.edu.cn/2021/0512/c25248a2360549/page.htm

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.04.034

制版人：十一

参考文献

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2. Simanshu, D. K., Nissley, D. V. & McCormick, F. RAS Proteins and Their Regulators in Human Disease.Cell170, 17-33, doi:10.1016/j.cell.2017.06.009 (2017).

3. Yaeger, R. & Corcoran, R. B. Targeting Alterations in the RAF-MEK Pathway. Cancer Discov 9, 329-341, doi:10.1158/2159-8290.CD-18-1321 (2019).

4. Chandarlapaty, S. Negative feedback and adaptive resistance to the targeted therapy of cancer.Cancer Discov2, 311-319, doi:10.1158/2159-8290.CD-12-0018 (2012).

5. Davies, H. et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer.Nature417, 949-954, doi:10.1038/nature00766 (2002).

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7. Pratilas, C. A. et al. (V600E)BRAF is associated with disabled feedback inhibition of RAF-MEK signaling and elevated transcriptional output of the pathway.Proc Natl Acad Sci U S A106, 4519-4524, doi:10.1073/pnas.0900780106 (2009).

8. Imielinski, M. et al. Oncogenic and sorafenib-sensitive ARAF mutations in lung adenocarcinoma.J Clin Invest124, 1582-1586, doi:10.1172/JCI72763 (2014).

9. Diamond, E. L. et al. Diverse and Targetable Kinase Alterations Drive Histiocytic Neoplasms.Cancer Discov6, 154-165, doi:10.1158/2159-8290.CD-15-0913 (2016).

10. Jain, P. et al. CRAF gene fusions in pediatric low-grade gliomas define a distinct drug response based on dimerization profiles.Oncogene36, 6348-6358, doi:10.1038/onc.2017.276 (2017).

11. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation.Cell80, 179-185, doi:10.1016/0092-8674(95)90401-8 (1995).

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