Nature | 体外培养人类8细胞类似细胞

撰文 | 十一月

温馨提示：本文可与今日BioArt第四条报道的类似工作Cell Stem Cell论文（8C-like cells capture the human zygotic genome activation program in vitro）报道相互参看！此外，BioArt今日还推出其它两篇分别发表在Science和Cell Stem Cell上的干细胞的相关工作，敬请关注！

在受精作用之后，静息状态的合子会经历一段基因组激活的爆发阶段，从而启动短暂的全能性。理解人类细胞全能性具有非常重要的意义。然而与小鼠相比，体外培养人类的模拟合子基因组激活（Zygotic genome activation，ZGA）阶段或者8细胞阶段的方法尚未见报道，这一研究受到来自伦理以及多种实验手段的局限。

为了弥补这一空白领域，2022年3月21日，中科院广州市生物医学与健康研究所Miguel A. Esteban研究组、Wenjuan Li研究组、深圳BGI Longqi Liu研究组以及中科院广州市生物医学与健康研究所Md. Abdul Mazid（第一作者）合作发文题为Rolling back of human pluripotent stem cells to an 8-cell embryo-like stage，作者们开发了一种从人类多能干细胞产生8细胞类似细胞的无转基因且快速可控的新方法，并通过多种高通量测序等分析方法确定了与转化相关的关键分子事件以及基因调控网络，为揭开人类胚胎发生的分子生物学过程方面的研究提供了一个新的平台。

人类多能干细胞是哺乳动物胚泡内细胞团中多能性细胞体外细胞系，可以用于研究早期胚胎发育。与小鼠一样，人类多能干细胞可以保持在动状态或naïve状态。在小鼠中，当其合子基因组激活阶段的2细胞类似细胞可以通过一定的操作提高存在的比例，在转录和表观遗传方面能够对基因组激活爆发阶段进行刻画。但是在转录和表观遗传方面能够匹配8细胞期阶段还尚未发掘。由于人类胚胎方面的材料非常有限，并且受到严格的伦理限制，能够被纯化以及富集的、真正的8细胞类似细胞尚缺乏。但这一工具又是了解人类胚胎发育、治疗不育症以及发育障碍所必须的重要工具平台。

为此，作者们希望尝试从人类多能性干细胞中产生8细胞类似细胞（图1）。首先，作者们用人类胚胎干细胞确定产生8细胞类似细胞的培养条件。第一轮筛选中，结合MEK抑制剂等培养具有naïve 多样性干细胞样细胞形态以及naïve多能基因表达最高水平的多能性干细胞细胞群。第二轮，作者们对14种额外的添加成分进行了检测。其中DZNep是腺苷半胱氨酸水解酶抑制剂，作者们发现在与组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA联用时会显著提高naïve多能性基因的表达。多能性干细胞到8细胞类似细胞的转化过程大约需要12天，在此过程中并没有明显的细胞死亡。

图1 从多能性干细胞中构建8细胞类似细胞

通过RNA-seq作者们证实了多能性干细胞来源的4细胞类似细胞与真正4细胞类似细胞具有转录相似性。作者们所开发的增强型4细胞类似细胞培养基能够提升全能性相关基因的表达。这些细胞的核型正常，但是不能通过传代进行扩展培养。在增强型4细胞的类似细胞中直接引入prime细胞方法也可以诱导全能性基因的表达，作者们将这种方法与前者阶段性诱导的方式进行了区分，将该方法称为直接诱导的增强型4细胞类似细胞。通过与先前的SMART-seq2 scRNA-seq数据库【1】进行比较，作者们确认E3细胞群中发生了向8细胞类似细胞身份的转变（图1）。

增强型4细胞类似细胞发育到第五天后，显示出与8细胞阶段相应的基因表达模式，比如关键的多能转录因子OCT4和SOX2下调等。作者们将这一群细胞称为的8细胞类似细胞。为了进一步确认所获得的是8细胞类似细胞，作者们构建了一个TPRX1-EGFP敲入报告细胞品系。TPRX1是在8细胞胚胎中高度表达的细胞标记转录因子。结果发现与人类合子基因组激活过程具有相似特征，说明从增强型4细胞类似细胞中分离出来的8细胞类似细胞能够表征真正的人类8细胞发育过程。

随后作者们通过单细胞ATAC-seq的方式对所获得8细胞类似细胞的染色质景观进行刻画，发现与内细胞团相比，8细胞类似细胞中富集的基因组区域染色质可及性增加与8细胞胚胎中H3K27ac标记的增加相关【2】。另外通过对早期胚胎富集的转录增强子区域染色质可及性的分析，作者们发现所获的8细胞类似细胞与8细胞其胚胎具有相似的开放模式。

进一步地，通过伪时间分析、基因表达动态变化的刻画，作者们发现有449个基因在8细胞类似细胞中的表达上调，少有基因下调。另外，通过基因本体论发现其中有多个基因与蛋白质合成以及RNA代谢过程相关。由此，作者们建立了8细胞类似细胞中的基因调控网络。随后，作者们将目光集中在了DPPA3以及TPRX1这两个高度上调的基因上。DPPA3是卵母细胞DNA甲基化的主调控因子，TPRX1是全能性细胞同源框家族转录因子。作者们发现DPPA3在整个8细胞类似细胞转化过程中诱导DNA去甲基化，而TPRX1是8细胞类似细胞基因网络的关键执行者。最后，作者们通过体外配培养等方式确定所获得8细胞类似细胞能够在体外形成胚状体或者具有更为复杂结构的畸胎瘤，进一步确认了其在体外的发育潜能和作为研究平台的潜能。

总的来说，作者们通过多轮筛选的方式构建了能够从人类多能性干细胞中培养8细胞类似细胞的方法，并对8细胞类似细胞的转录以及表观遗传特征进行了刻画，建立了相关基因调控网络，为体外研究人类早期胚胎发育过程提供了重要的工具。

https://doi.org/10.1038/s41586-022-04625-0

制版人：十一

参考文献

1. Petropoulos, S. et al. Single-cell RNA-seq reveals lineage and X chromosome dynamics in human preimplantation embryos.Cell165, 1012–1026 (2016)

2. Xia, W. et al. Resetting histone modifications during human parental-to-zygotic transition.Science365, 353–360 (2019)

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