FSHW｜金枪鱼深色肌肉肽通过肠道微生物群调节宿主肠道铁代谢，改善缺铁性贫血

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Introduction

01

缺铁性贫血（IDA）是全球发病率最高的营养缺乏性疾病之一，其发病率在发展中国家、经济不发达地区及婴幼儿、育龄妇女明显增高，在我国大约有20%的人口存在贫血症状。当机体对铁的需求与供给失衡，导致体内贮存铁耗尽（ID），继之红细胞内铁缺乏（IDE），最终引起缺铁性贫血（IDA）。肠道不仅是人体消化吸收的重要场所，同时也是最大的免疫器官，在维持正常免疫防御功能中发挥着极其重要的作用。作为人体最庞大、最复杂的微生态系统，肠道微生物本身及其代谢产物不仅能调节人体健康，更在膳食和宿主之间起到了重要的桥梁作用。

金枪鱼作为一种高档水产品，营养价值高。其蛋白质含量丰富，生物价高达90，氨基酸种类齐全、配比合理，富含DHA和EPA等多不饱和脂肪酸，是符合人体健康标准的理想食品。金枪鱼是一种洄游型红肉鱼，其暗色肉所占比例较高，相对于暗色肉中含有大量的DHA、DPA、EPA等多不饱和脂肪酸，还含有丰富的对人体有益的Ca、Fe、Zn等矿质元素。在金枪鱼加工过程中会产生大量的副产物，其中包括大量的暗色肉（约占原材料的50%~70%）。有的企业是直接将暗色肉丢弃，有的则是加工成饲料，这样造成暗色肉的利用率较低，如何提高暗色肉的价值是目前关注的一个热点。国内外对金枪鱼暗色肉的研究较少，仅有部分人研究了金枪鱼暗色肉的营养成分，抗氧化活性等。本实验以金枪鱼暗色肉为研究对象，采用酶解法酶解暗色肉，酶解多肽喂养小鼠，研究暗色肉酶解多肽对IDA小鼠的生理活性，另外通过16S高通量测序，研究暗色肉多肽对IDA小鼠肠道菌群的变化，并且提供了IDA症状的生物标志物，另外通过粪菌移植实验验证是否可通过菌群干预来实现IDA的发生于缓解，通过这些方面提高暗色肉的利用价值，充分利用金枪鱼的资源。

Results and Discussion

02

通过缺铁饲料辅以苯肼构建雌性小鼠IDA模型，金枪鱼暗色肉肽进行干预。在适应一周后，按照体重随机分成对照组（control），模型组（model），阳性药组（positive drug），多肽组(peptide)，除对照组喂食正常饲料，饮正常水，皮下注射生理盐水，其他3 组均喂食缺铁饲料，去离子水，注射苯肼。阳性药组按照150 mg/kg·day的剂量灌胃硫酸亚铁，多肽组按照150 mg/kg·day的剂量灌胃暗色肉多肽，模型组和对照组灌胃等量的生理盐水。在实验进行5周后，采集对照组、模型组和多肽组的粪便样本。在厌氧无菌环境中收集菌体，重悬于20%甘油中，分装储存。对照组、模型组和多肽组的上清液分别命名为溶液I、溶液II和溶液III。实验持续6周，每3天称一次重量和食物残渣。实验结束时，用安氟醚麻醉小鼠，从眶上动脉取血，将部分全血放入肝素抗凝管中，并在4 °C下储存。将剩余的全血在4 °C下以3 000 r/min离心15 min以制备血清，并在−80 °C下冷冻。将剩余的组织取出并储存在−80 °C下。

按照上述方法构建IDA雌性小鼠模型，4周后，将18 只小鼠随机分为3 组，即粪便微生物群移植（FMT）对照组、FMT模型组和FMT肽组，然后用溶液I、溶液II和溶液III灌胃（每只小鼠200 μL/day）。同时，三组小鼠还给予缺铁性食物和去离子水。9周结束时，收集粪便样本、血液样本和组织，并将其储存在−80 °C下进行分析。

金枪鱼暗色肉肽能有效恢复IDA小鼠的体重、食物摄入量和贫血相关指标

如图1A所示，喂养1 周后，注射苯肼小鼠体重明显降低，随着实验周期的推进，对照组和多肽组小鼠体重逐渐增加，而模型组和阳性药组小鼠体重增长趋势缓慢。图1B是小鼠平均每日摄食量，每组小鼠基础平均每天摄入3 g食物，1 周后注射苯肼，阳性药组和模型组小鼠平均摄食量下降较明显，随着实验的进行，所有组小鼠平均每日摄食量在逐渐增加。与对照组（（72.85 ± 3.02）g/L、（46.55 ± 8.64）mg/L和（9.80 ± 0.53）× 1012 cells/L）相比，模型组的血红蛋白含量（（57.40 ± 6.45）g/L，P < 0.05）、血清铁含量（36.72 ± 7.98）mg/L，P < 0.05）和红细胞计数（（4.90 ± 0.56）× 1012 cells/L，P < 0.05）显著降低。阳性药物和多肽治疗可以逆转这些现象，并使三项指标的水平趋向于对照组的值（（69.95 ± 5.56）和（76.67 ± 4.58）g/L；（56.35 ± 5.68）和（52.23 ± 7.86）mg/L；和（7.80 ± 0.45）× 1012和（9.60 ± 0.50）× 1012 cells/L）。

图1 金枪鱼暗色肉肽对IDA相关指标的影响

金枪鱼暗色肉肽在mRNA水平上改善铁代谢相关基因的表达

通过肝脏中储存的Ferritin、Transferrin、CAT、SOD和GSH-Px的表达以及十二指肠中DMT-1、DcytB、Ferroportin和Hephaestin的mRNA水平来研究暗色肉肽对IDA小鼠的影响。与对照组的水平相比，模型组的Ferritin、Transferrin、Dmt-1、Dcytb、Ferroportin、Hephaestin、CAT、SOD和GSH-Px的转录水平均降低，而阳性药物组和多肽组的这些基因表达水平均在一定程度上增加。此外，多肽组的SOD和GSH-Px转录水平显著高于阳性药物组（P < 0.05），而CAT水平高于阳性药物小组，但差异不显著（P > 0.05）（图2）。

图2 金枪鱼暗色肉肽对IDA小鼠转录水平的影响

金枪鱼暗色肉肽改变IDA小鼠肠道菌群组成

为了进一步研究暗色肉肽对IDA小鼠肠道菌群的影响，分析了Chao1指数和Shannon指数，这2 个指数指的是肠道微生物群落的丰富度和多样性。如图3A所示，模型组小鼠肠道微生物群的Chao1指数（835.81 ± 26.87）和Shannon指数（4.60 ± 0.35）低于其他组。通过加权UniFrac PCoA对4 组小鼠肠道微生物群的结构组成进行分析，小鼠的肠道微生物群各不相同，多肽组的肠道微生物组在某种程度上与对照组相似（图3B）。

如图3C所示，在纲水平上，缺铁模型组的梭菌纲（（7.10 ± 1.43）%，P < 0.05）和脱铁杆菌纲（1.70 ± 0.71）%，P < 0.05）的丰度显著低于对照组。然而，多肽组中梭菌纲的丰度（（13.45 ± 0.89）%，P < 0.05）和脱铁杆菌纲的丰度（3.53 ± 1.62）%，P < 0.05）增加。在属水平上，与对照组相比，模型组的乳酸杆菌属（17.90 ± 1.49）%，P < 0.05），XlVa梭菌属（7.01 ± 9.73）%，P < 0.05），双歧杆菌属（7.02 ±0.37）%，P < 0.05），瘤胃球菌属（0.07 ± 0.01）%，P < 0.05），梭菌（3.33 ±3.65）%，P < 0.05）和另枝菌属（0.23 ± 0.04）%，P < 0.05）的丰度显著降低。相反，螺杆菌属（12.79 ± 0.34）%，P < 0.05），异杆菌属（4.30 ±0.57）%，P < 0.05），脱硫弧菌属（10.32 ±0.11）%，P < 0.05）和奥氏菌（10.39 ± 0.26）%，P < 0.05）的丰度显著增加。与模型组相比，阳性药物组和多肽组的乳酸杆菌属丰度（（45.36 ± 1.83）%，P < 0.05；（26.44 ±1.75）%，P < 0.05），XlVa梭菌属（10.13 ± 0.64）%，P < 0.05；（20.01 ±0.63）%，P < 0.05）和双歧杆菌（14.25 ±0.93）%（P < 0.05）显著高于模型组；螺杆菌属（1.59 ±0.34）%，P < 0.05；（0.06 ± 0.01）%，P ＜ 0.05）丰度明显降低。此外，阳性药物组瘤胃球菌增加（（8.95 ± 0.92）%，P < 0.05），多肽组梭菌属增加（（18.86 ± 2.23）%，P < 0.05）（图3C）。

图3 金枪鱼暗色肉肽对IDA小鼠肠道微生物群的影响

通过冗余分析（RDA）共鉴定了37 种对金枪鱼暗色肉肽处理有反应的关键细菌（图4）。对37 种细菌与小鼠血红蛋白、血清铁含量和红细胞数量进行Spearman相关性分析。13 种关键细菌与至少一项生理生化指标显著相关（P < 0.05）。台湾乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、Blautia、梭菌属和脱硫弧菌属与血红蛋白、血清铁和红细胞数呈正相关，多肽组的相对丰度高于模型组。螺杆菌属与指标呈负相关，模型组的螺杆菌相对丰度高于多肽组。

图4 关键细菌与生理生化指标的相关性分析

移植暗色肉肽组粪菌的小鼠具有抗贫血作用

如图5A所示，在第1周和第4周，小鼠的体重显著下降。第一周注射苯肼引起急性溶血，体重显著下降。小鼠在第4周接受FMT，这导致体重下降。经过驯化后，小鼠的体重逐渐恢复。FMT肽组小鼠的体重增加得更快，而FMT模型组小鼠的重量增加得较慢。类似地，FMT肽组和FMT对照组小鼠的平均每日食物摄入量高于FMT模型组（图5B）。如图5C所示，FMT预防和减轻IDA的发展。与FMT对照组相比，FMT模型组的血红蛋白含量（（55.15 ± 3.05）g/L，P < 0.05）和血清铁水平（（50.23 ±4.97）mg/L，P < 0.05）显著降低，红细胞数（（5.98 ±0.84）×1012 cells/L，P > 0.05）也显著降低，但差异不显著。相反，FMT肽组能显著提高这三个指标，均高于FMT对照组。

转录水平的结果显示，与FMT对照组相比，FMT模型组中Ferritin、Transferrin、Dmt-1、Dcytb、Ferroportin、Hephaestin、CAT、SOD和GSH-Px的转录水平均下调，而FMT肽组逆转了下调趋势（图6）。

图5 FMT对IDA相关指标的影响

图6 FMT对IDA小鼠转录水平的影响

FMT改变IDA小鼠肠道微生物群组成

FMT后三组肠道微生物群的多样性和结构变化如图7A所示。FMT对照组和FMT肽组的Chao1指数和Shannon指数高于FMT模型组。三组肠道微生物群的结构不同，FMT对照组和FMT肽组之间存在一定的相似性（图7B）。

FMT后小鼠肠道微生物群在类和属水平上的变化如图7C所示。在纲别水平上，与FMT对照组相比，FMT模型组的拟杆菌纲、梭菌纲和疣微菌纲的丰度显著降低，杆菌纲、δ-变形菌纲和β-变形菌纲的丰度增加。与FMT相比模型组，FMT肽组能够显著逆转这些细菌的变化，使组成与FMT对照组相似。在属水平上，与FMT对照组相比，FMT模型组的乳酸杆菌属、瘤胃球菌属、异杆菌属和毛螺菌属的丰度显著降低，而梭菌属和螺杆菌属的丰度增加。相反，与FMT模型组相比，FMT肽组表现出乳酸杆菌属、瘤胃球菌属和异杆菌属的丰度增加，梭菌属、螺杆菌属和毛螺菌属的丰度减少（图7C）。

29 种细菌被发现与FMT引起IDA缓解的发展显著相关。使用Spearman分析了肠道微生物群的丰度与血清铁、血红蛋白和红细胞数量之间的相关性（图8）。结果显示，螺杆菌属与这三项指标呈显著负相关，FMT模型组的丰度高于FMT肽组。大肠杆菌与血红蛋白和血清铁呈显著负相关，FMT模型组的丰度高于FMT肽组。肠乳酸杆菌、梭菌属和另枝菌属与至少2 个指标显著正相关，并且它们的丰度在FMT肽组中更高。

图7 FMT对IDA小鼠肠道菌群的影响

图8 FMT后关键细菌与生理生化指标的相关性分析

Conclusion

03

在这项研究中，金枪鱼暗色肉肽改善了IDA的关键指标，调节了铁代谢，增加了肠道中有益细菌的丰度，降低了有害细菌的丰度从而缓解了IDA。移植金枪鱼暗色肉多肽组的粪便菌群取代了肠道中的原始微生物群，因此肠道微生物群的丰富性和多样性得到改善，微生物群的结构和组成与对照组更为相似，也可以起到缓解IDA的作用。本研究为IDA的临床治疗提供了新的策略，也为金枪鱼加工下脚料的高值化利用提供依据。

第一作者简介

韩姣姣，女，农学博士，宁波大学助理研究员，主持省部级项目2项，参与国家重点研发子课题1 项。发表论文 20余篇。主要从事海洋活性物质的开发及功效机制解析。

通信作者简介

周君，男，农学博士，宁波大学副教授，硕士生导师，生物芯片(北京)国家工程研究中心宁波分中心副主任，主持国家自然科学基金1 项，国家星火计划项目1项，国家重点研发子课题 1 项，省部级项目4 项。发表论文20余篇，授权发明专利12 项，获省市各类奖3 项，累计成果转化金额超过300万元。近年来主要从事食品质量与安全、水产病害检测与防治等领域的研究。

苏秀榕，女，工学博士，宁波大学教授，博士生导师，浙江省水产学会副理事长、浙江省生物化学与分子生物学理事，共承担国家、省、市各级各类项目40余项，获国家海洋局海洋科学技术奖，二等奖 1 项，浙江省科技进步奖，三等奖 2 项，宁波市科学技术奖，三等奖 2 项。获全国五一劳动奖章、全国巾帼建功标兵、浙江省劳动模范、浙江省农业科技成果转化推广奖、浙江省五一巾帼标兵、宁波市农业科技创新创业奖等，发表研究论文200余篇，获授权国家发明专利15项，出版教材和专著6部，实现多项专利成果转让，转让费超1 000万。近年来主要从事功能食品与海洋药物、食品质量与安全、生物化学与分子生物学等领域的研究。

Tuna dark muscle peptides modulate host iron metabolism in the intestine through the gut microbiota and ameliorate iron deficiency anemia

Jiaojiao Hana,b,#, Jiayi Xiongb,#, Zhixiang Baib, Yang Qinb, Chenyang Lua,b, Jun Zhoua,b,*, Ye Lia,b, Tinghong Minga,b, Zhen Zhanga,b, Xiurong Sua,b,*

aState Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Ningbo University, Ningbo 315832, China

bSchool of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315832, China

*Corresponding authors.

Abstract

Iron deficiency anemia (IDA) is a nutritional deficiency disease with a high incidence rate worldwide. Bioactive peptides are safe and effective, have multiple functions and can serve as potential candidates for alleviating IDA. In this study, the anti-anemia effects of tuna dark muscle peptides were explored in a diet-induced IDA mouse model. The results showed that tuna dark muscle peptides alleviated the IDA phenotype, oxidative stress and iron metabolism. In addition, tuna dark muscle peptides reversed gut microbiota dysbiosis in IDA mice. Furthermore, the transplanted fecal microbiota from tuna dark muscle peptide-treated mice also alleviated IDA symptoms and regulated iron metabolism and the gut microbiota, indicating that the anti-anemic effects were at least partially mediated by the gut microbiota. Thus, we identified a new and safe prebiotic material to alleviate IDA and provided ideas for the development of peptides. At the same time, these data also provided a theoretical basis for fecal microbiota transplantation to alleviate IDA.

Reference:

HAN J J, XIONG J Y, BAI Z X, et al. Tuna dark muscle peptides modulate host iron metabolism in the intestine through the gut microbiota and ameliorate iron deficiency anemia[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(2): 9250047. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250047.

本文编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意