诺奖得主Nature子刊：LNP递送新型RNP复合物，肺部基因编辑水平大大提升

CRISPR-Cas9基因组编辑技术有望为遗传疾病提供广泛的治疗。但挑战在于，病毒载体可能引起免疫反应，存在载体基因组整合的风险，并可能因为持续的基因编辑器表达而引起非目标DNA损伤。

LNP-mRNA复合物是非病毒衍生的体内递送载体，可实现靶向肝脏基因组编辑。但开发能够编辑非肝脏组织的LNP-mRNA复合物仍然是挑战。此外，LNP介导的递送面临的挑战包括sgRNA不稳定、mRNA介导的Toll样受体（TLR）激活以及编码基因组编辑器的大mRNA的低翻译效率。

以核糖核蛋白（RNP）复合物形式直接递送基因组编辑器，有可能解决与基于mRNA和病毒递送CRISPR编辑器相关的几个限制。特别是与mRNA相比，RNP会引起较低水平的TLR激活，并因为其短的细胞内半衰期而产生最小的非目标DNA损伤。此外，与基于mRNA的递送方法相比，RNP可能提供更高的体内编辑效率。

鉴于此，10月16日，加州大学伯克利分校Jennifer A. Doudna教授（2020年诺贝尔化学奖得主）和Niren Murthy教授团队合作，在Nature Biotechnology杂志发表论文。

他们从嗜热脂肪芽孢杆菌（GeoCas9）中设计了一种热稳定的Cas9，以生成iGeoCas9变体。与天然GeoCas9酶相比，该变体能够对细胞和器官以100多倍的效率进行基因组编辑。此外，iGeoCas9 RNP-脂质纳米颗粒（LNP）复合物可编辑多种细胞类型，并在接受共同递送的单链DNA模板（ssDNA）的细胞中诱导同源定向修复（HDR）。

具体来讲，研究人员首先通过定向进化将GeoCas9的编辑效率提高了几个数量级，并扩大了其原间隔序列临近基序（protospacer adjacent motif，PAM）兼容性。

图1. GeoCas9的定向进化提升了编辑效率

接下来，研究人员进一步优化了LNP组装参数，建立了一个强大的基于LNP的系统，用于将iGeoCas9 RNP递送到细胞系进行基因组编辑。此外，研究人员发现，iGeoCas9 RNP-LNP复合物可编辑多种细胞类型，并在接受共递送的单链DNA模板的细胞中诱导HDR。

然后，他们尝试让LNP把iGeoCas9 RNP与ssDNA模板共同递送。结果发现，RNP和ssDNA的共同递送诱导了特定位点的整合。研究人员又进一步发现，特异性可电离脂质可进一步提高编辑效率。

图2. iGeoCas9 RNP和ssDNA模板与LNP的共递送

最后，通过组织选择性LNP制剂，研究人员观察到，接受单次静脉注射iGeoCas9 RNP-LNP的小鼠肝脏和肺部的基因组编辑水平为16%-37%。此外，生物可降解LNP复合的iGeoCas9 RNP在肺组织中以19%的平均效率编辑了致病的SFTPC基因，与先前使用病毒或非病毒递送策略观察到的基因组编辑水平相比，这是一个显著的提升。

图3. iGeoCas9 RNP-LNP可有效编辑小鼠的肝脏和肺部

总结来说，该研究提出了一种新型的CRISPR基因编辑平台，利用LNP介导的热稳定基因编辑工具以RNP形式进行体外和体内的递送。作者创新性地使用具有高度热稳定性且功能增强的Cas9变体（iGeoCas9），结合新优化的LNP配方，实现RNP的高效封装和递送。

这种方法不仅能够进行传统的肝脏基因编辑，还能够实现肺部等更具挑战性的组织选择性基因编辑。此外，该策略可以通过ssDNA模板进行的HDR精确基因编辑，扩大了LNP辅助CRISPR疗法的应用潜力。

参考资料：

Kai Chen et al. Lung and liver editing by lipid nanoparticle delivery of a stable CRISPR–Cas9 ribonucleoprotein. Nature Biotechnology（2024）

https://www.nature.com/articles/s41587-024-02437-3

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