Science | 神经元Pcdh基因簇的表达调制

撰文丨十一月

原钙粘蛋白（Protocadherin，Pcdh） 是一类分布于中枢神经系统神经元表面的跨膜细胞粘连蛋白，其表达对神经元身份以及神经元之间连接的产生至关重要【1-2】。Pcdha基因呈簇状排列，表达范围有随机性也有一定的确定性。Pcdhα启动子具有较高的序列同一性、共享远端增强子，因此不同神经元中表达的选择性大概率不是或者不仅仅是依赖于转录因子结合的特异性。但是不同神经元中Pcdhα是如何选择表达的仍不清楚。为此，美国加州大学旧金山分校Daniele Canzio研究组在Science上发文题为Tuning cohesin trajectories enables differential readout of the Pcdha cluster across neurons，通过表观遗传学以及基因组折叠等方面的研究发现Pcdha启动子选择的概率取决于Cohesin催化的增强子/启动子相遇，其环挤出的轨迹决定了单个启动子可以逃脱异染色质所介导基因表达沉默。

在小鼠中存在58个Pcdh基因，在人类中存在60个Pcdh基因，这些基因串联形成三个基因簇α、β以及γ。Pcdh基因以及启动子相对于其转录增强子序列在其特异性表达调控中起到了重要作用。小鼠中14个Pcdhα基因在嗅觉感觉神经元中以相似的频率被选择性表达（图1）。最近的研究表明WAPL通过抵抗Cohesin复合体的DNA环挤出活性作为Pcdh表达调控的变阻器【3】。

Pcdhα基因在嗅觉感觉神经元中的表达是如何被调控的呢？首先，作者们通过荧光流式分选分离嗅觉感觉神经元，同时对这些细胞进行染色质可及性分析以及多种组蛋白修饰分析。作者们发现Pcdhαc1以及Pcdhαc2基因启动子区域表现出H3K9me3修饰消除以及高水平的H3K4me3。另外作者们对先前发现的两个Pcdhα转录增强子序列HS5-1以及HS-7进行了分析，发现两个增强子均具有高水平的开放染色质组蛋白修饰标记，但是只有HS5-1具有CTCF以及RAD21结合位点。

图1 Pcdhα基因在嗅觉感觉神经元中的表达特征

为了确定Pcdhα基因表达是否需要HS5-1的活性，作者们构建了具有HS5-1纯合敲除的小鼠模型，并进行了RNA-seq以及单细胞RNA-seq分析。作者们发现所有的Pcdhα基因表达在HS5-1纯合敲除的小鼠中均发生了显著降低，因此CTCF介导的Cohesin在HS5-1增强子处的滞留活性对于Pcdhα基因表达非常关键。

考虑到CTCF以及Cohesin在Pcdhα基因表达中的作用，作者们想知道增强子删除是否会影响Pcdhα基因组位点处的三维基因组结构。因此，作者们从野生型、HS5-1删除型、HS7删除型等分离嗅觉感觉神经元并进行Hi- C以及Capture-Hi-C分析。作者们发现在野生型小鼠的嗅觉感觉神经元中，Pcdhαc1以及HS5-1增强子会形成一个大约为130kb的拓扑结构域 。删除HS5-1并不会改变HS7与Pcdhαc2之间的相互作用；相反，在HS7删除后，HS5-1增强子与Pcdhα1-12启动子之间的相互作用会发生变化，主要表现为远端启动子与增强子结合增强而近端启动子与增强子结合减弱。

CTCF在Pcdhα基因处结合需要发育调节的Pcdhα基因启动子区域DNA甲基化，这一过程受到反义长链非编码RNAs （as-lncRNAs） 转录的影响。因此作者们想知道促进Pcdhα基因增强子活性是否需要通过起始as-lncRNAs的转录来促进Pcdhα基因启动子区域DNA去甲基化。为此，作者们进行了对野生型以及HS5-1增强子敲除型小鼠的嗅觉感觉神经元进行了亚硫酸氢盐全基因组测序。作者们发现HS5-1增强子敲除后DNA甲基化水平更高，同时as-lncRNAs的表达水平则更低。这些结果说明Pcdhα增强子对于Pcdhα启动子区域DNA去甲基化以及as-lncRNA的表达都是重要的。

之后，作者们对Pcdhα基因座的CTCF结合位点 （CBS） 的作用进行检测。通过对比野生型以及PcdhαCBS删除型嗅觉感觉神经元的RNAseq以及scRNA-seq，作者们发现Pcdhα12比上游基因相比表达更高，这与增强子/启动子结合偏好性相一致。另外，作者们预测加强PcdhαCBS边界将导致HS7增强子绝缘增强，同时也会减少HS5-1增强子/启动子相互作用的距离。据此，作者们设计了一个具有三个CTCF强结合位点的纯合小鼠品系，发现Pcdhα表达会出现HS7绝缘形似的表型（图2）。

图2 CTCF结合位点在Pcdhα基因表达中的作用

为了检测在嗅觉感觉神经元中Cohesin环挤出对于Pcdhα基因表达的作用原理在其他神经元是否也有相似，作者们对皮层神经元中Pcdhα基因表达的调节进行了检测。通过分析亚硫酸氢盐全基因组测序结果，作者们发现在皮层神经元中也具有相似的Pcdhα基因启动子区域甲基化特征，且Cohesin环挤出轨迹会影响神经元中特定的Pcdhα基因表达谱。

总的来说中，作者们的工作发现了三维基因组折叠与表观遗传基因沉默在串联排列的基因表达选择中的作用。这一发现对于神经系统中Pcdh基因组位点转录调控的理解具有重要的推动作用，同时也说明三维基因组结构潜在的复杂性是细胞基因表达模式多样性的基础。

原文链接：

https://doi.org/10.1126/science.adm9802

制版人：十一

参考文献

1. G. Mountoufaris, D. Canzio, C. L. Nwakeze, W. V. Chen, T. Maniatis, Writing, reading, and translating the clustered protocadherin cell surface recognition code for neural circuit assembly.Annu. Rev. Cell Dev. Biol.34, 471–493 (2018). doi: 10.1146/annurev-cellbio-100616-060701; pmid: 30296392

2. J. L. Lefebvre, D. Kostadinov, W. V. Chen, T. Maniatis, J. R. Sanes, Protocadherins mediate dendritic self-avoidance in the mammalian nervous system.Nature488, 517–521 (2012). doi: 10.1038/nature11305; pmid: 22842903

3. L. Kiefer et al., WAPL functions as a rheostat of Protocadherin isoform diversity that controls neural wiring.Science380, eadf8440 (2023). doi: 10.1126/science.adf8440; pmid: 37347873

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