类器官之父发表Science论文：类器官+CRISPR筛选，发现肠内分泌分化的关键抑制因子

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

2009年，荷兰 Hubrecht 研究所的Hans Clevers等人使用来自小鼠肠道的成体干细胞培育出首个肠道类器官，开创了类器官研究的时代。此后，类器官领域研究成果不断，许多新型类器官和更复杂的类器官不断涌现，为新药研发、精准治疗、再生医学等领域带来了更强大的工具。

2023年10月26日，Hans Clevers团队（林琳博士为论文第一作者和共同通讯作者）在国际顶尖学术期刊Science上发表了题为：Unbiased transcription factor CRISPR screen identifies ZNF800 as master repressor of enteroendocrine differentiation 的研究论文。

研究团队使用优化的人肠类器官培养系统，对调控肠内分泌细胞（EEC）分化的转录因子进行了无偏倚、系统筛选。该筛选表明，ZNF800是一个全新的抑制EEC分化的转录因子。

该研究展示了将人类器官用于CRISPR功能性筛选，也为识别人类肠道生理和病理中的其他调控因子因子铺平了道路。

肠内分泌细胞（EEC）是肠道特化的上皮细胞，与其他上皮细胞谱系一样，来源于区域特异性Lgr5+肠干细胞（ISC）。从ISC到EEC谱系的平衡分化受转录因子（Transcription Factors，TFs）网络的调控。

RNA测序和类器官技术已经阐明了EEC发育过程中基因表达谱的时间层次。通过使用Neurog3（内分泌发育主调控因子）的时间分辨率报告基因等位基因，在单细胞水平分辨率下构建了小鼠体内EEC分化的实时和谱系特异性图谱。过表达NEUROG3可以产生内分泌细胞，用于在人胰腺导管细胞中进行功能表征。利用人类肠道类器官，这一策略使沿近端-远端胃肠轴的EEC亚型的分析成为可能。已知在小鼠中特异性表达EEC亚型的转录因子在人类类器官中进一步检测，揭示了NEUROG3激活下游主要保守的调控机制。

然而，小鼠和人类数据之间存在差异。NEUROG3上游的调节机制和在成年期调控NEUROG3表达的内源性抑制因子在很大程度上仍然未知。

在这项最新研究中，研究团队将类器官技术与高通量CRISPR基因筛选技术结合，旨在建立一个跨越人类肠道类器官中全部转录因子（TFome）的CRISPR筛选平台，以便无偏倚和系统地发现调控人类EEC分化的转录因子。

研究团队使用通过慢病毒载体递送的CRISPR基因敲除文库，该文库包括7210个sgRNA，以靶向1800个人类转录因子，以及100个sgRNA阴性对照。

筛选结果显示，ZNF800是一个全新的抑制EEC分化的转录因子。

研究团队进一步解析了ZNF800调控ECC分化的机制，驱动早期ECC分化的核心参与者INSM1、SOX4和NEUROG3是ZNF800的下游直接靶点，ZNF800通过直接调控以PAX4为核心的内分泌转录因子网络，特别限制了肠嗜铬细胞的分化。在ZNF800缺失的情况下，PAX4通过抑制所有其他EEC亚型的分化来驱动EC特异性细胞命运。此外，PAX4还通过单方面抑制另一个EEC亚型转录因子ARX，来调控EEC亚型的分化。

我们发现ZNF800是肠内分泌分化的主要抑制因子，它通过直接控制以PAX4为中心的内分泌转录因子网络，特别限制肠嗜铬细胞分化。这也表明了可以通过类器官模型对编程细胞命运的基因进行无偏倚的功能性CRISPR筛选。

值得一提的是，2023年2月23日，Hans Clevers团队在Nature Biotechnology期刊发表了题为：Engineered human hepatocyte organoids enable CRISPR-based target discovery and drug screening for steatosis 的研究论文 【2】 。

该研究建立了新的人类脂肪肝类器官模型，并使用这些类器官模型来阐明药物反应，还建立了一个基于该类器官的CRISPR筛选平台，并成功筛选到了治疗脂肪肝的潜在新靶点——FADS2基因。

这些类器官模型及CRISPR筛选平台还有助于测试和开发治疗多种疾病的新药物，并有助于更好地了解疾病生物学。

论文链接：

1. https://www.science.org/doi/full/10.1126/science.adi2246

2. https://www.nature.com/articles/s41587-023-01680-4