Nature | 周珊珊等揭示细菌激素调控放线菌中抗生素生成的分子机制

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抗生素耐药已经成为全球范围内广泛存在的重要问题，开发新的抗生素来解决这一问题具有重要意义。一直以来，放线菌产生大量临床使用的抗生素及其他次级代谢产物，在医药和农业领域均有重要应用。放线菌中次级代谢产物生物合成基因簇的表达，经常受到扩散性细菌激素的调控。迄今为止，在放线菌中共发现了4类不同结构的细菌激素可调控抗生素的生成，包括γ-丁内酯类 （GBLs），2-烷基-4-羟甲基呋喃-3-羧酸类 （AHFCAs），4-烷基丁烯酸内酯类 （ABs）和2-烷基-4-羟基-3-甲基丁烯酸内酯类 （AHMBs）(下图)。这些小分子细菌激素常通过与TetR家族转录抑制因子 （TFTR）结合来调控代谢产物的产生，如γ-丁内酯类小分子A-factor在灰色链霉菌中通过与转录抑制因子ArpA作用，调控气生菌丝的形成和链霉素的产生。

近日，来自英国华威大学和澳大利亚莫纳什大学的Greg Challis团队和Christophe Corre团队 （共同一作为周珊珊、Hussain Bhukya和Nicolas Malet）合作在Nature杂志在线发表了研究论文“Molecular basis for control of antibiotic production by a bacterial hormone”，该研究阐述了放线菌中一类细菌激素AHFCAs与转录抑制因子相互作用，进而调控抗生素生物合成的分子机制。

放线菌模式菌株天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3 （2）生成一组呋喃类细菌激素AHFCAs，诱导次甲霉素 （methylenomycin）的生成。在该抗生素生物合成基因簇的一端，存在含有3个基因的操纵元负责AHFCA的生物合成。该操纵元上游的mmfR基因编码一个ArpA样的转录抑制因子MmfR，研究人员推测该蛋白可与次甲霉素生物合成基因簇中特定启动子区域结合以抑制启动子下游DNA的转录，AHFCA与之结合使其从启动子区域释放，从而启动该基因簇中转录激活因子mmyB的表达，进而激活次甲霉素的生物合成。尽管放线菌中TetR家族转录抑制因子调控抗生素耐药基因表达的过程已经比较清晰，但关于调控抗生素生物合成的ArpA样TFTR如何识别激素分子进而释放DNA的分子机制，目前仍所知甚少。

在该项研究中，研究人员通过对次甲霉素基因簇的生物信息学分析，在其基因簇中两个操纵元附近鉴定出两个长度为18个碱基对并高度同源的伪回文序列，凝胶迁移实验和荧光各向异性测量均显示MmfR可与该预期的两个操纵子 （operator）附近的DNA片段结合。DNA序列的微小差异可能导致它们对MmfR的亲和度也存在差异。天蓝色链霉菌产生的5种AHFCA分子不仅在体外实验中均可使MmfR与结合的DNA片段解离，在菌株抗生素诱导实验中同样可诱导次甲霉素的生成，同时AHFCA分子烷基侧链的结构差异导致他们的活性强弱略有不同。已知天蓝色链霉菌也会生成γ-丁内酯类激素分子如SCB1，其可调控另一生物合成基因簇 （coelimycin）的表达。研究人员采用合成的SCB1和凝胶迁移实验，发现SCB1无法解离MmfR与DNA的结合，从而揭示了GBL和AHFCA两类细菌激素调控通路的独立性。

应用X射线晶体衍射技术，该研究获得了转录抑制因子MmfR及其与AHFCA小分子结合的蛋白复合物的三维结构 （分辨率1.5Å）。其中N端前三个α螺旋形成DNA结合结构域 （DBD），α螺旋4-9构成了激素结合结构域 （HBD），α螺旋8和9形成同源二聚化界面。6个氨基酸残基形成容纳激素分子烷基侧链的疏水口袋，另外若干关键氨基酸残基与激素分子的羧基和羟甲基极性部分形成氢键作用。由于MmfR与DNA操纵子 （operator）片段复合物的结晶很难获得，该研究应用单颗粒冷冻电镜技术得到了MmfR-DNA复合物的三维结构 （分辨率4.2 Å）。其中，两个MmfR同二聚体结合到DNA双链的相对面上。结合MmfR-AHFCA复合物的晶体结构，研究人员发现同二聚体内DBD之间的距离从蛋白-激素复合物中的47.6Å减小到了蛋白-DNA复合物中的37.6Å。这种构象变化，显示蛋白在与激素分子结合后导致的DNA结合结构域向激素结合结构域方向上移，阻止了MmfR与DNA双链大沟的结合 （下图）。

接着研究人员通过与放线菌中其他已知激素分子类别的ArpA样转录抑制因子的序列比对，发现在所有ArpA样转录抑制因子中，除口袋底部的氨基酸残基外，形成烷基链结合口袋的大部分残基高度保守。多个残基特别是Q130和Y85在结合AHFCA类激素的转录抑制因子中均保守存在。MmfR与AHFCA激素分子之间以及MmfR蛋白结构内部通过各种氢键、疏水作用和极性作用，引发从激素结合结构域到DNA结合结构域的信号转导，从而促使α螺旋6的C-末端下移和α螺旋4的N-末端内移，进而拉动α螺旋1的N-末端朝向激素结合结构域移动，重新定位DNA结合结构域。其他ArpA样转录抑制因子可能采取类似的信号转导机制。研究人员采用定点突变生成了MmfR的Y85F和Q130E突变体，凝胶迁移实验和荧光各向异性测量均显示这些残基在蛋白与激素的相互作用中具有关键作用。此外，研究者还设计合成了一系列天然AHFCA激素分子的类似物，探讨了分子中不同官能团对与MmfR相互作用的影响，总结其构效关系。

总的来说，该项研究通过对次甲霉素中转录抑制因子与对应细菌激素及DNA操纵子的相互作用的探索，阐明了在细菌激素存在下ArpA样转录抑制因子识别配体并发生信号转导从而释放DNA调控抗生素表达的分子机制。这些发现将有助于开发细菌激素及其相关的转录抑制因子在合成生物学和新抗生素发现中的应用。在过去的二十年中，仅有少数几个四聚体TFTR-DNA结构被报道，显示出X射线晶体学分析在这些系统中所面临的挑战。相信冷冻电镜的使用将促进对类似复合物的结构表征，从而有助于从分子水平理解其他转录因子的调控机制。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-021-03195-x

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