科研进展 | 非洲猪瘟病毒蛋白CD2v与宿主CSF2RA相互作用调节JAK2-STAT3通路并抑制细胞凋亡以促进病毒复制

由华南农业大学的龚浪课题组在Journal of Virology上所发表的题为《African Swine Fever Virus Envelope Glycoprotein CD2v Interacts with Host CSF2RA to Regulate the JAK2-STAT3 Pathway and Inhibit Apoptosis to Facilitate Virus Replication》的文章，该文主要介绍了非洲猪瘟病毒囊膜糖蛋白CD2v与宿主CSF2RA相互作用调节JAK2-STAT3通路并抑制细胞凋亡以促进病毒复制的机制。

1.ASFV GZ201801株可诱导宿主细胞凋亡。

显微镜下观察到感染ASFV GZ201801株的PAM出现细胞质空泡化和细胞尺寸缩小等严重的细胞病变(CPE)(图1A)。透射电子显微镜还显示，ASFV感染的PAM细胞体积缩小，细胞质密度和核膜密度增加，细胞膜形成囊泡，细胞膜结构完整(图1B)。用1MOI的ASFV感染PAM，并与2.5mM的z-VAD-FMK(泛半胱氨酸氨基转移酶抑制剂)、Belnacasan(半胱氨酸氨基转移酶-1选择性抑制剂)、Fec-statin-1(铁下垂抑制剂)和Necrostatin-1(细胞坏死抑制物)与ASFV组相比，所有药物处理的PAM的存活率均显著提高(图1G)，表明ASFV感染可通过多种方式诱导细胞死亡，包括细胞凋亡、下垂、铁下垂和细胞坏死。

2.ASFV GZ201801早期抑制细胞凋亡，后期促进细胞凋亡。

以往的研究表明，ASFV GZ201801株可诱导宿主细胞凋亡。因此，作者用Western blotting检测了裂解caspase3蛋白和促凋亡蛋白Bax的表达水平。与对照组相比，ASFV感染使这两种蛋白的表达水平升高。抗凋亡蛋白Bcl2和Bclxl的表达水平先上升后下降(图2A)。检测对照组和ASFV治疗组各时间点的细胞凋亡率，并计算其差值。流式细胞仪检测显示，与对照组相比，ASFV感染组早期细胞凋亡率呈下降趋势，晚期细胞呈上升趋势(图2B)。这些结果表明，ASFV在感染早期抑制细胞凋亡，在后期激活细胞凋亡。

3.ASFV GZ201801感染PAM的转录产物分析

ASFV感染PAM 3、12和48h后，进行转录测序。分析结果表明，与对照组相比，感染3h后有1,775个上调基因和1,449个下调基因，12 h后有3,023个上调基因和2,657个下调基因，48 h后有2,087个上调基因和2,056个下调基因(图3A、C和E)。

在感染后3、12、48h对上调的差异基因进行KEGG分析。感染后3h，差异表达基因在细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、C型凝集素受体信号通路、IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路、Th17细胞分化、趋化因子信号通路、造血细胞谱系、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、Th1和Th2细胞分化、RIG-L样受体信号通路中显著丰富(图3B)。感染后12h，细胞因子-细胞因子受体相互作用、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路、C型凝集素受体信号通路和JAK-STAT信号通路均显著丰富(图3D)。感染后48h，DEGS在破骨细胞分化、剪接体、代谢途径、溶酶体、细胞凋亡、吞噬小体和C型凝集素受体信号通路中显著丰富(图3F)。

这些结果表明，ASFV在感染早期激活JAK2-STAT3信号通路，在感染后期激活细胞凋亡通路。利用KEGG途径富集化分析网站分析JAK2-STAT3途径的相关因素。IL-6细胞因子被发现激活JAK2-STAT3途径，促进STAT3在细胞核中的磷酸化，上调下游蛋白Bcl2和Bclxl的表达，从而达到抗凋亡作用(图3G)。

4.ASFV GZ201801感染可激活JAK2-STAT3途径。

为探讨ASFV对JAK2-STAT3途径的调节作用，研究了JAK2-STAT3途径抑制剂AG490和穿心莲内酯(AND)对PAM的细胞毒作用。选择了AG490(100 MM)和(30 MM)(图4A和B)的最佳浓度用于后续实验。用MOI为1的ASFV感染PAM，用最适浓度的途径抑制物处理PAM，用逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测IL-6的表达水平。IL-6在ASFV感染早期上调，AG490和AND显著抑制IL-6的表达(图4C)。此外，Western blotting显示，在ASFV感染的早期阶段，JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平上调。相反，AG490和AND下调了ASFV感染诱导的P-JAK2和P-STAT3的表达水平(图4D)。

提示ASFV感染可促进IL-6的表达并激活JAK2-STAT3通路，而AG490和AND可抑制IL-6的表达并下调JAK2-STAT3通路。

5.抑制JAK2-STAT3通路可促进ASFV GZ201801诱导的细胞凋亡。

由于ASFV感染可诱导细胞凋亡，作者检测了感染后3、12、24、36和48h以及JAK2-STAT3途径抑制剂AG490和AND处理前后PAM中凋亡相关蛋白的表达。抑制JAK2-STAT3途径后，裂解的caspase3蛋白和促凋亡蛋白Bax的表达水平在ASFV感染的早期阶段增加。此外，抗凋亡蛋白Bc l-xl的表达水平降低(图5)。这些结果表明，抑制JAK2-STAT3通路可以显著促进ASFV诱导的PAM凋亡。

6.抑制JAK2-STAT3通路对ASFV GZ201801在PAM中复制的影响

为了探讨JAK2-STAT3通路对ASFV在PAM中复制能力的影响，作者采用定量聚合酶链式反应(QPCR)检测AG490和AND处理后ASFV复制的变化。我们发现AG490和AND抑制ASFV的病毒载量(图6A、D和G)。此外，Western blotting显示AG490和AND可以抑制ASFV P30蛋白的表达水平(图6B、E和H)。免疫荧光分析还表明，AG490和AND可以显著抑制ASFV P30蛋白的水平(图6C、F和I)。这些结果表明，AG490和AND抑制JAK2-STAT3通路可以抑制ASFV的复制。

7.CD2v诱导STAT3磷酸化触发JAK2STAT3途径。

为了确定与触发JAK2-STAT3途径有关的病毒包膜蛋白，将ASFV包膜蛋白p12、CD2v、p22、p54和p32在HEK293T细胞中过表达，并利用双荧光素酶报告系统筛选它们上调STAT3启动子的能力。在这些蛋白质中，CD2v显示了最大的作用(图7A)；因此，它被选择进行进一步的检测。免疫印迹法检测ASFV感染过程中P30和CD2v蛋白表达水平的变化。结果表明，PAM感染ASFV 3h后可检测到CD2v的表达，但表达水平低于P30(图7B)。在感染ASFV 12h的PAM中分析了内源性CD2v和STAT3蛋白，并在ASFV感染后用共聚焦显微镜观察到STAT3的核易位(图7C)。在PK-15细胞中，单独转染STAT3 36h后，STAT3定位于细胞质内。然而，当与ASFV CD2v共转染时，共聚焦显微镜下观察到36小时后STAT3蛋白发生显著的核易位(图7D)。这些结果表明，ASFV感染可以诱导STAT3的核易位，ASFV的CD2v蛋白促进STAT3的磷酸化并将其转位到细胞核内，从而触发JAK2-STAT3途径。

8.GZ201801-ΔCD2v下调JAK2-STAT3途径，促进细胞凋亡。

为了进一步验证ASFV CD2v蛋白在JAK2-STAT3途径中的调控机制，本研究首次构建了CD2v缺失株GZ201801-ΔCD2v，并对其生物学特性进行了研究。用同源重组方法将表达CD2v的EP402R基因替换为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(图8A)。同时，GZ201801-ΔCD2v基因组中的全长EP402基因被扩增，而EP402R的全长核酸片段不能被扩增(图8B)。用荧光显微镜观察GZ201801-ΔCD2v株的EGFP，发现缺失病毒可以表达绿色荧光(图8C)。用流式细胞仪检测GZ201801-ΔCD2v株(图8D)的EGFP表达。以上结果表明，GZ201801-ΔCD2v缺失株构建成功。其次，分析了GZ201801和GZ201801-ΔCD2v株的生长曲线，发现GZ201801野生株和GZ201801-ΔCD2v株的增殖和生长水平相似(图8E)。用Western印迹法检测ASFV-GZ201801野生株和GZ201801-ΔCD2v缺失株在PAM感染过程中P30蛋白的表达水平，两株的生长水平相似(图8F)。在MOI为1时，GZ201801-ΔCD2v株感染的PAM的IL-6水平比GZ201801株感染的细胞下调(图8G)。Western blotting表明，GZ201801-ΔCD2v抑制了JAK2和STAT3蛋白的磷酸化(图8H)。显微镜和流式细胞术显示GZ201801-ΔCD2v感染诱导的细胞死亡高于GZ201801诱导的细胞死亡(图8I和J)。此外，Western blotting显示早期感染GZ201801-ΔCD2v可上调裂解caspase3蛋白的表达水平，抑制抗凋亡蛋白Bcl2的表达(图8K)。

9.ASFV CD2v和CSF2RA相互作用，调节JAK2-STAT3途径

在之前的研究中，作者进行了酵母双杂交试验，发现ASFV CD2v蛋白可与宿主蛋白CSF2RA相互作用，已知CSF2RA作为细胞因子受体激活JAK2-STAT3下游途径。因此，该文进一步研究了ASFV CD2v与CSF2RA的相互作用。用共聚焦显微镜观察到CD2v和CSF2RA在PK-15细胞中的共存(图9A)。

此外，在HEK-293T细胞中进行了免疫共沉淀实验，以评估CD2v是否与CSF2RA复合体相互作用。 如(图9B)所示，CSF2RA与CD2v共沉淀。 为了进一步证明CSF2RA在CD2v调节JAK2-STAT3途径中的作用，作者在宿主细胞中用siRNA干扰CSF2RA蛋白(图9C)。 经CSF2RA siRNA处理的ASF2RA感染细胞的Western印迹分析表明，抑制CSF2RA的表达降低了ASFV诱导的JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平，增加了裂解caspase3的表达，并抑制了早期感染过程中Bcl2的表达。 同时，ASFV P30蛋白的表达受到抑制(图9D)。 这些结果表明，CSF2RA与CD2v相互作用，激活JAK2-STAT3通路，在感染早期抑制ASFV诱导的细胞凋亡，从而维持病毒的复制。 在CSF2RA的siRNA干扰后，ASFV感染早期激活的JAK2-STAT3通路可以下调，促进细胞凋亡，抑制病毒复制。 为了进一步探讨CD2v如何与CSF2RA相互作用来调节JAK2-STAT3通路的激活，作者研究了CSF2RA与KAP1之间的相互作用。 KAP1是STAT3的负转录调节因子，它的抑制可以促进STAT3的磷酸化进入细胞核。 通过共聚焦显微镜和免疫共沉淀实验，作者发现CSF2RA与KAP1(图9E和图F)相互作用，表明ASFV激活PAM中的JAK2-STAT3途径是通过抑制KAP1促进STAT3磷酸化进入细胞核所致。

总结

目前，还没有商业化的抗ASFV疫苗或抗病毒药物。作者证明了ASFV通过JAK2-STAT3途径复制。更具体地说，ASFV CD2v与CSF2RA相互作用，激活JAK2-STAT3途径，抑制细胞凋亡，从而维持感染细胞的存活，促进病毒复制。该研究揭示了JAK2-STAT3途径在ASFV感染中的重要意义，并确定了CD2v进化为与CSF2RA相互作用并维持JAK2-STAT3途径激活以抑制细胞凋亡的新机制，从而阐明了ASFV对宿主细胞信号重新编辑的新发现。

来源：ZhaoSunLab