上海
基因治疗的核心目标之一，是将一段功能正常的基因“原装”替换患者体内的致病序列。然而，这一目标长期面临关键技术瓶颈——如何在不引入双链断裂（DSB）的前提下，将基因级别大小（>1 kb）的 DNA 片段高效、精准地写入哺乳动物基因组。
精准大片段基因插入一直是基因编辑领域的“硬骨头”。基于 DSB 的 NHEJ/HDR 策略存在随机插入、细胞毒性及体内递送效率低等问题；以prime editing（PE）为核心的新一代工具（如 PASTE、PASSIGE）虽避免了 DSB，但依赖整合酶或重组酶，仍存在 junction scar、免疫原性及递送复杂性等挑战。更关键的是，现有 PE 相关技术在 >400 bp 插入时效率显著下降，距离真正的基因治疗应用仍有差距。此外，质粒供体在体内摄取效率低且易激活免疫反应，也限制了其转化潜力。
近日，The Ohio State University 医学院刘彬团队，联合 UMass Chan Medical School RNA 治疗研究所薛文与Erik J. Sontheimer团队，在Nature杂志发表了题为： 的研究论文，报道了一种全新的大片段基因组插入策略——Prime Assembly（PA）。该方法实现了从0.1 kb到11 kb的精准插入，对0.8 kb供体的插入效率最高可达50%，且无需DSB、重组酶或同源定向修复（HDR）。
PA 的核心思路简洁而巧妙：twin prime editing（twinPE）可在基因组靶点两侧生成约 35 nt 的单链 flap。如果将线性双链 DNA（dsDNA）供体两端设计为与这些 flap 互补，是否可以利用细胞内源修复机制，实现大片段 DNA 的精准拼接？研究者将 PCR 扩增获得的线性 dsDNA 供体与 PE6c 及 twin-epegRNA 共转染至 HEK293T 细胞，成功在 AAVS1 位点实现 0.8 kb、2.2 kb 和 4 kb 片段的高效定向插入，效率显著优于 evoCAST 和 PAINT 3.0。值得注意的是，PA 不依赖外源 DNA 聚合酶，在 G1 及 G2/M 阻断条件下依然高效，提示其机制独立于细胞周期及经典 HDR 通路—这一特性对于原代细胞和体内应用尤为重要。
此外，利用了多项技术创新提升效率与精准性：① DNA-PK 抑制提升效率：NHEJ 抑制剂 AZD-7648 可显著提升 PA 效率，并将 flap 区域 indel 率由 12–17% 降至 9% 以下；结合 odsDNA 供体时，错误率可降至 ~0.6%，接近测序背景水平；② 3′ 悬挂单链供体（odsDNA）：通过 λ 外切酶处理 PCR 产物生成 3′ 悬挂结构，提高与 flap 的退火效率，大幅提升精准度；③ 细胞内 Gibson 拼装（多供体 PA）：受 Gibson Assembly 启发，研究者将长供体拆分为多个具有约 30 bp 重叠的片段，实现细胞内多片段同步拼装插入，为突破 AAV 4.7 kb 递送限制提供了新思路；④ 多样化供体形式：包括单链 DNA（ssDNA）在内的多种供体形式均适用于 PA，进一步增强了供体设计与递送的灵活性。
作为技术能力的关键验证，研究团队成功将 11.3 kb 的 DMD（抗肌萎缩蛋白）cDNA 精准插入 AAVS1 位点，并通过 ddPCR、junction PCR 及 Nanopore 长读长测序多重验证其准确性。此外，PA 还可将 2.4 kb 的 CD19 CAR-P2A-GFP 精准整合至 TRAC 位点，为 CAR-T 细胞治疗提供了有力工具。研究团队开发了适用于 PA 的脱靶检测方法 PA-tag（基于 PE-tag/UDiTaS 改良）。全基因组分析显示，PA 具有高度位点特异性，无论使用 dsDNA、odsDNA 还是 ssDNA 供体，均未检测到显著脱靶信号。
Prime Assembly的提出，为基因组大片段精准插入提供了一条兼具高效率、高精准性与高简便性的新路径。其“无 DSB、无整合酶、无质粒、供体可由 PCR 直接制备”的特点，为未来非病毒体内递送奠定了重要基础。尽管 PA 的分子机制仍有待进一步阐明，其体内应用仍面临关键挑战，包括 DNA-PK 抑制策略的安全性评估以及高效递送体系的建立。随着这些问题的逐步解决，PA 有望在基因治疗领域展现出广阔的应用前景。
刘彬为第一作者及共同通讯作者，薛文与 Sontheimer 为共同通讯作者。目前 Bin Liu 教授课题组正在招聘博士后，欢迎有兴趣的研究人员联系咨询。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-026-10460-4
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