神经环路应用（34）丨单细胞RNA测序技术

单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）是一种在单个细胞水平上全面分析基因表达谱的高通量技术。它突破了传统批量RNA测序（bulk RNA-seq）只能获得组织平均表达信号的局限，能够揭示细胞间的异质性、发现新型细胞类型、描绘发育轨迹并解析疾病状态下细胞状态的动态变化。

核心原理

scRNA-seq的核心原理是在单个细胞水平上捕获并定量其全部mRNA分子，从而解析个体细胞的基因表达谱。

Fig1 批量测序（左侧）和单细胞测序（右侧）的 RNA-seq 数据分布情况

左侧（Bulk RNA 测序）：动物占比 83.2%，植物 7.3%，微生物 6.7%，真菌 2.8%。可见传统测序虽以动物为主，但其他类群（植物、微生物）仍有一定占比。

右侧（单细胞 RNA 测序）：动物占比飙升至 98.3%，植物、微生物、真菌占比仅 0.7%、0.7%、0.3%。说明单细胞技术目前几乎 “垄断” 动物研究，其他类群（尤其是植物、真菌）的单细胞研究严重不足。

实验步骤

单细胞RNA测序流程包括：分离单细胞 → 裂解并逆转录mRNA为带UMI和barcode的cDNA → 扩增并建库 → NGS测序 → 通过聚类、降维（t-SNE/UMAP）和拟时序分析等解析细胞类型与功能。

样本制备：

获取新鲜组织或细胞悬液；

机械/酶消化组织，制备单细胞悬液；

过滤（40 μm滤网）、离心洗涤，去除细胞团块和碎片；

裂解红细胞（如需要），并通过台盼蓝染色或流式检测确保细胞活率 > 80%；

调整细胞浓度至平台要求（如10x Genomics：700–1200 cells/μL）。

单细胞捕获与标记：

使用微流控系统（如10x Chromium）、微孔板或纳米芯片平台，将单个细胞与带有细胞条形码（cell barcode）和唯一分子标识符（UMI）的凝胶珠共包裹；

每个细胞的mRNA被独立标记，实现后续细胞来源识别与分子定量。

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细胞裂解与逆转录：

在微滴或反应孔中裂解细胞，释放mRNA；

利用含poly(T)序列的引物进行逆转录，生成带有barcode和UMI的一链cDNA。

cDNA扩增

通过PCR（或部分方法使用体外转录IVT）对cDNA进行全基因组扩增；

纯化扩增产物，质检（如Qubit定量、Bioanalyzer检测片段大小）。

文库构建：

将cDNA片段化；添加测序接头（P5/P7）和样本索引（index）；构建基因表达文库（必要时可同时构建Feature Barcode文库用于多组学）；文库纯化并定量。

高通量测序：

使用Illumina平台进行双端测序：Read 1：读取cell barcode + UMI；Read 2：读取cDNA转录本序列；

推荐测序深度：微滴法约20,000–50,000 reads/细胞。

数据质控与生物信息学分析（后续步骤）。

总结

单细胞RNA测序适用于解析细胞异质性、发现新型或稀有细胞类型、重建发育与分化轨迹、刻画肿瘤微环境、揭示疾病机制（如神经或免疫疾病）、评估药物响应及构建器官细胞图谱，是研究复杂组织和动态生物学过程的强大工具。

文献引用

• Arya, A., Tripathi, P., Dubey, N. et al. Navigating single-cell RNA-sequencing: protocols, tools, databases, and applications. Genom. Inform. 23, 13 (2025). https://doi.org/10.1186/s44342-025-00044-5

• Woo H, Eyun SI. Applications and techniques of single-cell RNA sequencing across diverse species. Brief Bioinform. 2025 Jul 2;26(4):bbaf354. doi: 10.1093/bib/bbaf354. PMID: 40698863; PMCID: PMC12284766.

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