神经环路应用（32）丨条件性敲除关键基因技术

条件性敲除关键基因技术（尤其是基于 Cre-loxP 系统）已成为神经环路研究的核心工具，它能够实现对特定脑区、特定细胞类型或特定发育/行为时间窗中目标基因的精准失活，从而解析该基因在神经环路结构与功能中的作用。

Cre（Cre重组酶）是酪氨酸位点特异性重组酶（T-SSRs）家族的一员，该家族还包括Flp（翻转酶）和Dre（D6特异性重组酶）。Cre最初是在噬菌体P1中发现的，由cre（cyclization recombinase，环化重组酶）基因编码，产生一种分子量为38 kDa的DNA重组酶。Cre能够识别特定的DNA序列oxP（locus of x-over, P1）位点并介导两个loxP位点之间DNA片段的位点特异性删除。loxP位点是一段34 bp的DNA序列，由两个13 bp的反向重复且呈回文结构的臂和中间8 bp的核心序列组成。

Cre-loxP 系统的基本原理

Cre-loxP 系统是哺乳动物基因编辑中广泛应用的一项强大技术，其优势在于操作简便、重组效率高且无需额外辅助因子即可完成高效DNA重组。该系统的核心机制是：单个 Cre 重组酶可识别两个同向排列的 loxP 位点，并切除两者之间的 DNA 片段（即“floxed”序列），从而产生一个环状的游离 DNA 和一条缺失目标基因 Y 的染色体，使该基因失活。除了删除，Cre-loxP 还可根据 loxP 位点的相对方向和位置，介导 DNA 的倒位或易位。

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条件性基因敲除小鼠的构建

要实现时空特异性的基因操作，需两个关键元件：

1. Cre 驱动小鼠：在特定组织或细胞类型中表达 Cre 重组酶（由组织特异性启动子控制）；

2. floxed 小鼠：目标基因 Y 两侧被 loxP 序列包围。

通过将两种小鼠杂交，可在特定细胞中实现基因 Y 的条件性敲除。重组的空间特异性由启动子/增强子决定，时间特异性则取决于 Cre 表达的时间窗口。

可诱导型 Cre-loxP 系统：CreERT

为实现更精确的时空调控，研究者开发了药物诱导型 Cre 系统，如 CreERT（也称 Cre-ERT）。

CreERT 是将 Cre 与突变型雌激素受体配体结合域（ER-LBD）融合而成；在无诱导剂时，CreERT 与热休克蛋白 HSP90 结合，滞留于细胞质；当给予合成类固醇（如他莫昔芬tamoxifen或其活性代谢物 4-OHT）后，HSP90 解离，CreERT 转位入核识别 loxP 位点并启动重组。CreERT2其对 4-OHT 的敏感性比原始 CreERT 高约 10 倍，因此在体内实验中更为常用。

Fig1. Cre-loxP系统的作用机制

（A）Cre-loxP系统概览：38 kDa的Cre重组酶可识别特定的34 bp loxP DNA序列。

（B）利用loxP和Cre驱动小鼠品系构建条件性突变的常规繁育策略：原则上，一只小鼠需携带组织特异性启动子驱动的Cre基因，另一只小鼠则携带目标基因Y两侧被loxP序列“包围”（即“floxed”）的等位基因。Cre重组酶的表达会切除floxed区域，从而使基因Y失活。

Fig2. 可诱导型 Cre-loxP 基因突变系统原理

(A) 他莫昔芬(Tam)诱导的雌激素受体融合 Cre 系统（CreER）

在无 Tam 时，CreER 融合蛋白与热休克蛋白 90（HSP90）结合，滞留于细胞质中（1）；

给予 Tam 后，Tam 与雌激素受体（ER）结构域结合，破坏 CreER 与 HSP90 的相互作用（2）；

CreER 随即转位进入细胞核（3）；

在核内，CreER 识别 loxP 位点（4），切除 floxed 区域，从而在特定组织 X 中使目标基因 Y 失活（5）。

(B) 四环素诱导系统——Tet-on 模式

使用广泛性或组织特异性启动子驱动 rtTA（反向四环素调控转录激活因子）表达；

无 Dox（强力霉素）时，rtTA 处于非活性状态，无法结合 cre 基因上游的 tetO7（含7个19 bp tetO 序列的最小启动子，也称 TRE）；cre 不表达；

给予 Dox 后，Dox 与 rtTA 结合使其活化，rtTA 结合 tetO7 启动子，启动 cre 表达，进而介导 loxP 位点间的重组。

(C) Tet-off 模式

无 Dox 时，tTA（四环素调控转录激活因子）处于活性状态，可结合 tetO7 启动子，驱动 cre 表达；

给予 Dox 后，Dox 与 tTA 结合使其失活，无法结合 tetO7，cre表达被关闭，重组停止。

总结

他莫昔芬诱导的 CreERT 系统通过控制 Cre 入核实现时间精准调控；而 Tet-on/off 系统则通过 Dox 控制 cre 基因的转录开关。两者均可与组织特异性启动子联用，实现对基因功能在特定细胞、特定时间的精准操控，已成为神经科学、发育生物学和疾病建模等领域的核心技术。

文献引用：

• Kim H, Kim M, Im SK, Fang S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Lab Anim Res. 2018 Dec;34(4):147-159. doi: 10.5625/lar.2018.34.4.147. Epub 2018 Dec 31. PMID: 30671100; PMCID: PMC6333611.

• Gong S, Doughty M, Harbaugh CR, Cummins A, Hatten ME, Heintz N, Gerfen CR. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. J Neurosci. 2007;27(37):9817–9823. doi: 10.1523/JNEUROSCI.2707-07.2007.

• Meinke G, Bohm A, Hauber J, Pisabarro MT, Buchholz F. Cre Recombinase and Other Tyrosine Recombinases. Chem Rev. 2016;116(20):12785–12820. doi: 10.1021/acs.chemrev.6b00077.

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