用于病毒疫苗生产的悬浮培养Vero细胞系特性研究

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摘要

Vero细胞经世界卫生组织（World Health Organization, WHO）批准，在过去25年中一直是病毒疫苗生产中最常用的连续细胞系，但其贴壁生长特性仍限制了生产效率。若能适应悬浮培养，将突破这一限制并降低生产成本。本研究首先获得了悬浮培养的Vero细胞克隆并对其进行代谢特性分析；其次，通过RNA测序（RNA sequencing, RNA-Seq）分析鉴定贴壁细胞与悬浮细胞间的差异表达基因，发现与黏附及基质相关的基因完全下调；此外，还发现Wnt信号通路及其他酪氨酸激酶受体相关信号通路可能是优化细胞生长的潜在靶点，其中添加成纤维细胞生长因子2（Fibroblast Growth Factor 2, FGF2）可使细胞密度提高20%。最后，病毒生产效率对比实验表明：根据血清型不同，悬浮Vero细胞的脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）产量较贴壁细胞提高30%，呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus, RSV）产量提高140%，黄热病病毒（Yellow Fever Virus, YFV）产量提高150%。本研究证实了悬浮Vero细胞系作为病毒疫苗生产新细胞平台的潜力。

结果

1、悬浮Vero细胞的生长速率

从亲本贴壁细胞获得悬浮Vero细胞后，对其生长速率进行评估，并与贴壁Vero细胞对比（图1A）。贴壁细胞在传代后第1天进入滞后期，第2-3天增殖加速，第3-4天达到增殖峰值，第8天生长停滞。培养8天后达到最高密度（3.4×10⁵个/平方厘米），但在传代扩增的第4天，细胞密度为2.3×10⁵个/平方厘米。第1-4天期间，贴壁细胞的PDT约为27小时。

将悬浮Vero细胞离心稀释后，前24小时生长缓慢，第2-3天达到生长峰值，第4-7天生长速率放缓。第7天达到最高细胞密度（1.4×10⁶个/毫升），第4天传代时细胞密度为1.2×10⁶个/毫升。第1-4天期间，悬浮细胞的PDT约为39小时。

图1 悬浮细胞（紫色）与贴壁细胞（绿色）在9天培养周期内的生长动力学及代谢物浓度变化

2、代谢物产生

高效的能量代谢是细胞生长的关键，因此本研究对细胞培养上清液中的葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和铵离子等代谢物进行分析，并比较贴壁Vero细胞与悬浮Vero细胞的代谢差异。

首先，贴壁Vero细胞与悬浮Vero细胞所用培养基的初始葡萄糖浓度不同（图1B）。在细胞增殖峰值期，葡萄糖消耗速率更高：悬浮细胞在培养前3天葡萄糖消耗速率较高，随后趋于平稳；而贴壁细胞在第3-4天葡萄糖消耗速率升高。在所有培养条件下，即使培养9天后，葡萄糖浓度仍未成为悬浮细胞生长的限制因素；仅贴壁细胞在第9天出现葡萄糖浓度限制。总体而言，贴壁细胞的葡萄糖消耗量高于悬浮细胞。

在乳酸浓度方面，悬浮细胞在前2天产生更多乳酸，随后产生速率放缓，培养9天达到累积稳定浓度（约11 mM）（图1B）；贴壁细胞在第4天前产生更多乳酸，之后产生速率下降，培养9天后达到最高浓度（26 mM）。

其次，对谷氨酰胺分解代谢相关代谢物进行分析。培养前4天，贴壁细胞与悬浮细胞的谷氨酰胺消耗速率相近；之后贴壁细胞的谷氨酰胺消耗速率下降，因谷氨酰胺浓度成为生长限制因素，而悬浮细胞的初始谷氨酰胺浓度更高，未出现此现象（图1C）。最后，两种细胞系的铵离子产生量相近，第9天达到峰值（约3.5 mM）。

3、转录组分析

对贴壁Vero细胞和悬浮Vero细胞进行不同时间的扩增培养，在复苏后第5、15和25代收集冻存细胞 pellet 进行RNA测序分析。所有时间点和细胞类型均设置3个生物学重复。通过3' RNA-Seq分析处理FastQ文件，鉴定出两种细胞群体间的差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。

3.1差异表达的时间变化

通过主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）评估两种细胞系随时间的变化及样本间的变异性。主成分分析的两个主轴覆盖了超过80%的方差（图2）。

与贴壁细胞不同，悬浮Vero细胞的转录组图谱随时间略有变化，不同代次的悬浮细胞在主轴PC1上分离更明显（图2）。然而，这种变化仅涉及74个基因（补充数据1）。基因本体（Gene Ontology, GO）分析显示，悬浮细胞中随时间上调的差异表达基因与细胞因子活性相关（表1），其中IL1A、IL1B、CXCL2和CXCL8的表达显著增加（图3A）。传代次数增加还与内源性和外源性通路介导的凋亡信号改变相关（表1）：内源性通路中关键上调基因包括CHAC1、DDIT3和TRIB3（图3B）；外源性通路中关键上调基因包括NGF、IL1B、IL1A和G0S2。20代培养过程中下调的基因与细胞外基质相关（表1），包括CDH6、VCAN、MMP1和ANOS1（图3C）。

表1 悬浮Vero细胞20代培养过程中上调或下调基因显著富集的基因本体（GO)

图2 基于RNA-Seq DRaMA（使用EdgeR分析）获得的前250个差异表达基因的主成分分析

图3 悬浮Vero细胞20代培养中与贴壁细胞相比的关键上调或下调基因

3.2 差异表达基因概述

第25代时，火山图显示贴壁细胞系和/或悬浮细胞系共表达11182个基因（图4A）。在悬浮细胞与贴壁细胞间共鉴定出858个差异表达基因，其log₂倍变化（log₂ Fold Change, log₂FC）绝对值≥2且p值≤0.05（火山图中红色圆点），占总基因表达的7.7%。韦恩图显示（图4B），与贴壁细胞相比，悬浮细胞中657个差异表达基因下调，201个差异表达基因上调。值得注意的是，悬浮细胞中基因表达下降的幅度大于贴壁细胞，超过75%的差异表达基因呈下调趋势。这表明Vero细胞适应悬浮培养的特征之一是基因表达略有下降。

图4 悬浮细胞与贴壁细胞基因表达的整体比较

3.3 差异表达基因分析

对悬浮细胞中下调基因的GO分析显示，大量GO术语与细胞外基质、黏附连接或质膜相关（补充表1）。代谢通路分析显示，与黏附相关的通路（如细胞间连接形成、紧密连接相互作用、黏附连接相互作用）显著下调（表2）。例如，在悬浮Vero细胞中，细胞间连接形成代谢通路（Reactome数据库）中有30%的基因下调（图5A），包括关键黏附基因CDH6、CLDN10、CLDN4、CLDN3、CRB3和CADM1（图5B）。此外，“跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性”是下调基因中突出的分子功能GO术语之一，关键基因包括CSF1R、FGFR2、NRP1和RET（图5C）。

代谢通路分析还发现，与贴壁细胞相比，悬浮细胞中另一条与增殖相关的通路——Wnt信号通路显著下调（表2），其中WIF1、IGFBP4和FZD6等基因表达下调，而DKK1基因表达显著上调（图5D）。这些发现为未来优化细胞生长提供了方向。

如前文代次比较所述，悬浮培养中上调基因的GO术语还与细胞因子活性和细胞因子受体结合相关（补充数据2），包括炎症相关信号通路（表2）。

表2 悬浮培养适应过程中改变的代谢通路

图5 悬浮适应过程中代谢通路及基因的下调

3.4 病毒受体

如前所述，Vero细胞因能支持多种病毒复制而被广泛应用，因此病毒受体表达的稳定性至关重要。第25代时，贴壁细胞与悬浮细胞的病毒受体表达无显著差异（表3）。

表3 贴壁Vero细胞与悬浮Vero细胞中病毒关键受体的表达情况

4、细胞生长优化

基于转录组分析结果，评估培养基优化对悬浮细胞生长的促进作用。首先通过添加Wnt3A和DKK1抑制剂WAY-262611激活Wnt信号通路，但未观察到细胞增殖变化；相反，添加强效Wnt激动剂SKL2001分子3天后，细胞增殖能力显著抑制（下降30%）（数据未展示）。这表明Wnt通路在这些细胞中受到严格调控，且发挥关键作用。向培养基中添加成纤维细胞生长因子2（FGF2或bFGF）后，传代3天内细胞生长呈剂量依赖性改善：2.5 ng/mL浓度时细胞密度增加约8%，20 ng/mL浓度时增加17%（图6）。

图6 传代3天后细胞密度（%）随培养基中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）浓度的变化

5、病毒生产效率

为评估两种细胞的病毒生产能力，用三种不同科属的病毒感染贴壁Vero细胞和悬浮Vero细胞。对于脊髓灰质炎病毒，在相同培养体积下，悬浮细胞与贴壁细胞的1型抗原D（Antigen D, AgD）产量相近，分别为214 UI/mL和199 UI/mL（图7A）；而3型抗原D产量方面，悬浮细胞（189.5 UI/mL）显著高于贴壁细胞（146.5 UI/mL），相同培养体积下产量提高近30%（图7B）。对于黄热病病毒，悬浮细胞与贴壁细胞的产量差异具有统计学显著性（p值=0.003），相同培养体积下，悬浮细胞的病毒滴度为8.08 log₁₀半数细胞培养感染剂量/毫升（50% Cell Culture Infectious Dose/mL, CCID₅₀/mL），贴壁细胞为7.68 log₁₀ CCID₅₀/mL，产量提高150%（图7C）。对于呼吸道合胞病毒，悬浮细胞的病毒滴度峰值为7.61 log₁₀ CCID₅₀/mL，贴壁细胞为7.21 log₁₀ CCID₅₀/mL；在收集细胞数量相近的情况下，悬浮细胞的病毒滴度提高142%（图7D）。

图7 悬浮细胞与贴壁细胞病毒滴度比较

用于病毒疫苗生产的悬浮培养Vero细胞系特性研究

原文链接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12141672/

DOI:10.1038/s41541-025-01157-2

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