多年磨一剑！韩春雨团队再取进展

Argonaute促进的靶向是一种酶介导的、高保真的、高效的碱基配对过程，可以重新用于升级PCR技术。来自嗜热Caloramator sp.（CalAgo）的Argonaute蛋白在65°C的Tte-UvrD解旋酶存在下切割靶dsDNA，表明dmCalAgo（一种核酸酶失活突变体）在相同条件下与靶dsDNA结合。

2025年4月22日，杭州微编生物科技有限公司韩春雨、高峰共同通讯在bioRxiv在线发表题为“Introducing An Argonaute-facilitated Isothermal Amplification Technology”的研究论文，该研究通过dmCalAgo、Tte-UvrD解旋酶和Bst DNA聚合酶的协同作用设计了一个Argonaute促进的等温PCR平台（等温Ago-PCR）。

等温Ago-PCR在65°C下实现了模板的扩增。升级在于用Argonaute促进的靶向取代引物退火。因此，等温Ago-PCR不仅消除了对复杂引物设计和精密仪器的依赖，而且实现了高保真和高效的扩增。该平台能够在30分钟内检测到低拷贝模板（每个反应仅3个拷贝），实现了与qPCR相当的灵敏度，同时展示了优异的扩增动力学。该平台还展示了与常见热维护工具的兼容性。因此，等温Ago-PCR有可能取代qPCR，具有广泛的适用性。

该研究通过DNA引导的DNA pAgos（包括TtAgo、NgAgo和CbAgo）的比较序列分析，从嗜热细菌Caloramator sp.ALD01（NCBI序列ID:WP_027308646.1）中筛选出Argonaute蛋白，并将其命名为CalAgo[1,2]。体外切割试验表明，CalAgo具有DNA引导的内切酶活性，而dmCalAgo（一种核酸酶失活突变体）消除了可检测的内切酶能力。此外，研究人员系统地表征了CalAgo的酶学性质。就二价金属阳离子依赖性而言，CalAgo在Mg²⁺存在下表现出切割活性⁺, Mn²⁺, Co²⁺,或Ca²⁺,观察到Mg²⁺的最佳效率⁺ Mn²⁺。

等温Ago-PCR的理论工作模型（图源自bioRxiv）

在Tte-UvrD解旋酶存在的情况下，CalAgo表现出强大的dsDNA切割活性。这种协同效应可能源于解旋酶介导的dsDNA解旋到瞬时ssDNA区域，随后允许CalAgo/gDNA复合物进行序列特异性结合和切割。因此，这种协同效应可以重新用于等温放大中的退火升级。通过将切割缺陷的dmCalAgo突变体和Tte-UvrD解旋酶与链置换DNA聚合酶（如Bst-LF）结合，提出了一种Argonaute促进的等温扩增平台，称为等温Ago-PCR。

该研究表明，等温Ago-PCR平台对M13mp18模板显示出强大的扩增效率，凝胶电泳分析中清晰的产物积累证明了这一点。此外，等温Ago-PCR在环状ssDNA、线性dsDNA和质粒中也实现了相当的扩增效率，显示出广泛的模板多样性。对等温Ago-PCR和常规qPCR之间的灵敏度和扩增动力学进行的基准分析显示，前者具有显著的性能优势。定量评估表明，等温Ago-PCR的灵敏度（每个反应3个拷贝）与qPCR相当，反应动力学显著加速。关键的是，等温Ago-PCR仅使用常见的热维护工具就实现了低拷贝靶标（每个反应<10个拷贝）的灵敏检测。这些流线型硬件要求将平台定位为现场可部署的护理点诊断解决方案。

参考信息：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.04.21.649904v1