BI最新公开pro-IL12融合蛋白，NHP最高无严重毒性剂量可达3mg/kg！

▌IL-12研究进展

IL-12是一种异二聚体的细胞因子，由p40及p35两个亚基组成，是主要的促炎因子之一，可以刺激活化的T细胞和NK细胞的抗肿瘤效应功能，从而实现实体瘤排斥，在肿瘤免疫中扮演着关键角色，与该靶点相关的在研管线就有百余条，备受MNC青睐。但自2020年BMS前期付款4.75亿美元，宣布将获得Dragonfly公司DF6002的全球独家许可后，IL12的光环却逐年减退，其较短的半衰期及毒性一直是IL-12临床应用的主要限制因素。基于此，目前针对IL12的优化方向主要包括一下几个方面：

1. 通过瘤内注射，减少IL-12在全身循环中的分布，从而减少系统性副作用。例如，使用溶瘤腺病毒或纳米粒子(IL-12 mRNA)介导的递送方式直接作用于肿瘤部位。代表管线有由亦诺微研发的T3011瘤腺病毒，现已进入 II期临床并获得FDA快速通道认证，用于治疗既往铂类化疗和PD1/PDL1疗法失败的复发或转移性头颈部鳞状细胞癌患者。

2. 设计IL-12的突变体或融合蛋白，如融合表达Fc或白蛋白，以改善其药代动力学特性，减少其在体内的快速清除，同时保持或增强IL-12的生物活性，Dragonfly公司的DF6002就属于IL-12的Fc融合蛋白。

3. 使用IL-12前体药物（pro-IL-12），设计在肿瘤微环境中特异性激活的IL-12前体，例如使用细胞外IL-12Rβ1的细胞因子结合域作为遮盖物“掩盖”住IL-12，从而阻断了通常与免疫细胞结合并激活它们的分子部分。代表管线有由Xilio Therapeutics研发的XTX301，据称，其 I期临床的安全性数据显示，XTX301的给药剂量可高达45μg/kg（几乎是rhIL12最大耐受剂量的100倍）且未观察到剂量限制性毒性。2024年3月28日，Gilead以超6亿美元引进Xilio的IL-12前药。

4. 联合使用其他免疫调节剂：例如，将IL-12与氢氧化铝结合，形成IL-12-明矾颗粒，这种颗粒在注射到肿瘤组织后能缓慢释放IL-12，激活免疫系统，同时避免了全身性使用免疫刺激药物时可能出现的毒性反应。

5. 抗体融合蛋白，依托于抗体较强的靶向性，帮助IL-12 在特定的位置发挥效应。辉瑞2023年公开的WO2023242769A1提供了一种IL-12与pd-1抗体的抗体融合蛋白。

6. Armoured CAR/TCT-T，将IL-12的表达控制在特定免疫细胞，如T细胞中。Armoured CAR/TCT-T是细胞治疗突破血液瘤进军实体瘤的重要方式之一，为了增强免疫细胞的杀伤能力，共表达强效的促炎细胞因子，IL-12成为近年Armoured CAR/TCT-T比较热门的共表达细胞因子。

▌WO’768的pro-IL-12结构设计

本次介绍的前沿专利是申请人为勃林格殷格翰于2024-07-25公开的WO2024153768A1，后文简称WO’768，以独特的结构结合了IL-12前体药物，IL-12Fc融合蛋白以及TME结合基序的优化方式，有效降低了IL-12的毒性并优化了其药代动力学特性。

WO’768公开了包含Fc修饰的pro-IL-12，其中pro-IL-12选用anti IL-12p40 VHH作为mask，Fc采用双抗中常用的knob-in-hole结构。基于以上单元提供了下图中A-H的结构三个小圆球为p40亚基，大圆球为p35亚基，带星号的浅灰色细线为可切割的linker，深色细线为不可切割的linker。

上述结构相应的代表构建体如下图表8所示，其结构的区别主要有以下几个方面：

1. IL12及mask是否由可切割的linker相连并连接于相同的Fc：E-H由可切割的linker相连并连接于相同Fc的同二聚体；A-D中IL12与mask连接于不同的Fc，且为Fc包含knob-in-hole的异二聚体结构。A-D的结构设计将VHH mask固定在Fc上，Fc的knob-in-hole结构相较于常规的Fc也具有更强的稳定性，在linker没有被切割的情况下，可防止scfv由于与抗原的结合作用而丧失遮蔽作用导致的毒性。

2. IL12及mask连接于Fc的C端/N端：A, C, E, G的IL12及mask位于N端；B, D, F, H位于C端。权利要求中仅保护了位于C端的结构，且无位于N端结构相关实施例。

3. IL12的p40亚基及p35亚基之间是否包含linker：C ,D, H中不包含p40-p35间linker，这与其他pro-IL-12的设计有所不同，但实施例并未验证p40-p35间linker是否会对pro-IL-12活性造成影响。

▌WO’768 pro-IL-12创新点及活性数据

p40 mask VHH及cleavable linker的筛选，分别在WO’768的实施例2-3中，本文不过多赘述，主要展示优选结构的活性数据，即基于Format B的BI-051，BI-057及BI-059，具体序列信息见实施例4表13。除上述结构的创新点外，WO’768 还对pro-IL-12进行了如下改造，

1. 为了增强pro-IL-12的肿瘤靶向性，在上述结构的基础上增加TME ECM蛋白（如胶原，肝素或纤连蛋白）结合基序。其中BI-051与BI-057包含collagen I结合基序，BI-059包含纤连蛋白结合基序

2. 由于人源IL12不会对鼠IL12R发生效应，而人鼠嵌合IL12可对鼠IL12R发生效应，针对IL12还设计了全人源及人鼠嵌合IL12(人源p40-小鼠p35)。其中BI-051中为全人源IL12，BI-057及BI-059为人鼠嵌合IL12。

下面主要看一下上述优选构建体在安全性，肿瘤抑制以及药代动力学的表现。

在BI-051的体内遮蔽效应及体内安全性测定中，将剂量提升至3mg/kg后，NHP仍可保持健康状态，ALT，胆红素和肌酐均未升高，无临床毒性症状。相较于XTX301的最高剂量45μg/kg，BI-051提升了近70倍。

在MC38荷瘤小鼠中，使用BI-051(2.8 mg/kg)连续注射两次，第二次处理后1天收集肿瘤，与注射空载小鼠相比，治疗动物瘤内IFNγ显著增加，可证明功能性IL-12的释放。

在MC38结肠癌C57BI/6小鼠肿瘤模型(肿瘤体积70-100mm3，剂量0.5mg/kg)中，结果如下图所示，相较于不包含TME结合基序的嵌合BI-065，BI-059的安全性有了明显的提升。

在药代动力学方面，在EMT6乳腺癌Balb/c小鼠肿瘤模型，通过注射Dylight 650标记的BI-200或BI-051(剂量50 pg)，通过荧光MS成像评估蛋白保留情况。结果显示相较与不包含TME结合基序的人源BI-200，BI-051的保留效果有着显著的增加。

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