脑声常谈丨头戴式荧光显微成像技术：推进自由活动小鼠的神经科学研究

过去光学神经成像通常使用笨重的台式光学显微镜，这种显微镜体积庞大，需要对动物进行麻醉或固定头部，限制了能够进行的实验类型。近年来随着微型光学元件和电子设备的发展，光学神经成像设备逐渐从台式平台向“头戴式”平台转变。使用遗传学工具对自由活动的小鼠进行神经元活动成像。

微型头戴式荧光显微镜能够以较高的分辨率对自由移动的动物大脑中的神经活动进行观测，既可以通过颅骨开窗对大脑皮层的神经活动进行成像，也可以通过结合梯度折射率（Gradi-ent Index，GRIN）透镜（将光学图像从一端中继到另一端）对大脑深部的神经活动进行成像，迅速增强了对大脑如何工作的理解。目前，微型头戴式荧光显微镜的主流方案是基于单光子荧光成像的微型显微镜和基于双光子荧光成像的微型显微镜。对于单光子荧光成像，荧光染料中的电子吸收激发光中的一个光子被激发到高能级，然后当电子从高能级向低能级跃迁时会发出一个比激发光波长更长的光子。单光子荧光效应比较容易发生，使用LED作为激发光源提供宽场照明就能够得到生物成像所需的荧光信号，系统构建更加容易。但是宽场照明产生的离焦荧光会对成像质量造成影响，并且由于激发光的波长相对较短，光束散射效应也比较明显。所以微型单光子荧光显微镜的优点是成像视场更大、帧频更高、成本更低、更易于组装和维护，且允许动物有更加自由的运动行为。其缺点是穿透深度小，轴向分辨率低，图像的对比度也比较低。

所以微型双光子荧光显微镜的优点是穿透深度更大，轴向和横向分辨率更高，有研究报道的微型双光子荧光显微镜的横向分辨率为0.65 μm，轴向分辨率为3.3 μm。其缺点是系统构建更加复杂，需要昂贵的近红外飞秒激光器来提供激发光，并且还需要使用较粗的光纤束进行图像传输，对动物的行为会造成一定的影响。

小视场微型单光子荧光显微镜（FOV<1mm）在近些年得到了巨大发展，技术日趋成熟，研究人员在设计满足荧光成像的基本功能之上，还加入了很多其他功能，例如：加入无线功能以解除电线对动物行为的限制；利用三维成像解决单光子荧光成像穿透深度小的问题；开发双区域成像功能实现同时对两个脑区进行成像；加入双色/多色成像功能解决对不同神经细胞群同时进行成像的问题。

第一个完全集成的微型头戴式荧光显微镜，总重量仅为1.9g，体积为2.4 cm3，该显微镜由光学系统、照明LED、CMOS探测器、结构外壳和电子线路组成。光学系统极为简单，物镜仅是一片GRIN透镜，管镜为一片消色差双胶合透镜。照明光由LED发出，经过收集透镜、激发滤光片、二向色镜和物镜后，照明神经细胞；激发的荧光经物镜、二向色镜、发射滤光片和管镜成像在CMOS上。该系统的成像质量完全能与台式显微镜相媲美。

Fig1 具有基本成像功能的系统

（a）Ghosh等人的集成显微镜的横截面图；（b）MiniScopeV3的分解图; （c）戴着微型显微镜的小鼠示意图；（d）小鼠大脑中神经元活动的荧光图像

Miniscope是一种光学元件高度集成的荧光显微镜，高度20毫米左右，质量仅约3克。超小的体积使其可戴在实验动物头上长时间记录自由活动时的神经元活动，是神经科学研究的重要工具。在仿体实验与动物实验中，MiniMounter均可有效评估对焦的显微镜图像质量，实现自动对焦。在动物实验中，通过该方法可对小鼠脑部的毛细血管精确自动对焦，空间分辨率达到0.8微米，观测到直径5 微米内的毛细血管。在三维成像算法中，采用空间变化反卷积算法（SV-Deconvolution）使得仅有二维成像功能的Miniscope实现了高质量的三维成像。微型头戴式荧光显微镜已成为神经科学领域的重要工具，特别是对于清醒啮齿动物的行为研究。Miniscope用于追踪神经环路活动观察神经元之间的微妙联系和信号传递。钙离子成像和光刺激（激活或抑制）可同步进行，钙离子探针+光遗传视蛋白，生物干扰最小，信噪比最大化。

Fig2 Miniscope结构及原理

动物行为

可记录在感觉诱发性刺激、旷场行为、社交互动以及从清醒到睡眠的过渡过程中整个背皮质的中等尺度钙活动。微型无线荧光显微镜 (miniScope)，可以以单细胞分辨率记录大脑神经活动。头戴式显微镜的进步使得能够使用遗传工具对自由移动的小鼠的神经元活动进行成像，但这些显微镜仅限于在光线最暗的场所进行记录和对上皮层进行成像；新开发的显微镜技术允许科学家在动物自由活动的情况下进行研究，可以在执行悬尾、社交互动或小鼠跳跃等行为测试时，捕捉到高分辨率且稳定的神经活动图像。这种技术使得在动物进行觅食、哺乳、跳跃、玩耍和睡眠等自然行为时，科学家能够长时间观察到神经突触、神经元、神经网络以及远程脑区之间的多尺度和多层次的动态变化；微型双光子显微镜（mTPM）来获取自由行为小鼠的体感皮层的延时高分辨率小胶质细胞图像，以及脑电图/肌电图记录和行为视频；Miniscope还可用于监测动物在跑步机运动激活神经元，同时可以评估动物的焦虑抑郁等情绪。

Fig3 miniscope

文献引用：

1.Klioutchnikov A, Wallace DJ, Sawinski J, Voit KM, Groemping Y, Kerr JND. A three-photon head-mounted microscope for imaging all layers of visual cortex in freely moving mice. Nat Methods. 2023 Apr;20(4):610-616.

2.Rynes, M.L., Surinach, D.A., Linn, S. et al. Miniaturized head-mounted microscope for whole-cortex mesoscale imaging in freely behaving mice. Nat Methods 18, 417–425 (2021).

3.Zhu X, Gu L, Li R, Chen L, Chen J, Zhou N, Ren W. MiniMounter: A low-cost miniaturized microscopy development toolkit for image quality control and enhancement. J Biophotonics. 2024 Feb;17(2):e202300214.

4.付强,张智淼,赵尚男,等.微型头戴式单光子荧光显微成像技术研究进展[J].中国光学(中英文),2023,16(05):1010-1021.

5.Barbera G, Liang B, Zhang L, Li Y, Lin DT. A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice. J Neurosci Methods. 2019 Jul 15;323:56-60.

6.Yanny, K., Antipa, N., Liberti, W. et al. Miniscope3D: optimized single-shot miniature 3D fluorescence microscopy. Light Sci Appl 9, 171 (2020).

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