青岛农业大学工程化谷氨酸棒状杆菌全细胞生物合成肌酸

肌酸是一种天然存在于人体内的氨基酸衍生物，在维持高度代谢活跃的组织（尤其是肌肉和大脑）内的 ATP 水平方面发挥着关键作用。

在人体内，肌酸主要在肝中利用三个不同氨基酸合成，这三个氨基酸包括精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸。合成后 95% 的肌酸被贮存于骨骼肌中，剩下的存在于大脑、心脏和睾丸中。身体每天分解 1-2％ 的肌肉肌酸，需要大量的肉和鱼才能获得足量的肌酸。

目前，工业上肌酸的合成主要依靠化学方法，存在反应时间长、操作步骤复杂、产品纯度较低等问题。且在生产过程中，需要使用剧毒的氰胺，或者产生次优结果，造成重大安全隐患并增加生产成本。

此外，通过化学方法合成的肌酸味道以苦味为特征，不适合直接用作食品添加剂。后续需要使用脱苦剂处理，从而导致处理程序复杂且收获率仅为 50%。与传统的有机化学品生产相比，微生物生产的利用提供了一种更安全、更环保的生产方法。

近日，青岛农业大学副教授邓阳联合江南大学陈坚院士利用谷氨酸梭菌作为全细胞生物催化剂合成肌酸。通过优化肌酸合成途径和全细胞生物催化系统，提高肌酸滴度，为肌酸的工业化生产提供了一种更安全、环保的方法。

相关文章以题为“Efficient biosynthesis of creatine by whole-cell catalysis from guanidinoacetic acid in Corynebacterium glutamicum”发表在Synthetic and Systems Biotechnology期刊。这项工作由国家自然科学基金和青岛市科技计划重点研发项目资助。

邓阳现为青岛农业大学食品科学与工程学院副教授、硕士生导师。获青岛市城阳区创新创业领军人才称号，入选青岛农业大学第一批优秀人才“特支计划”骨干人才；兼任青岛特种食品研究院科研处处长等。长期致力于微生物新资源食品制造及质量调控方面的应用基础研究，尤其是在啤酒酿造及酿酒微生物代谢调控方面有着扎实的科研基础和丰富的实践经验。

全细胞生物催化为高效和可持续生产肌酸提供了一条有前途的途径。这种方法具有许多优点，包括高生产率、成本效益、简化下游加工和提高产品回收率。已经有大量研究探索了全细胞生物催化在生产各种化合物中的应用，例如低聚果糖、红素苷和一系列其他食品和添加剂，证明了其在该领域的多功能性和潜力。

革兰氏阳性谷氨酸棒状杆菌因其特征明确的遗传背景和全面的基因操作工具箱而被广泛认为是安全（GRAS）生物，并被确立为模式微生物。因此，谷氨酸棒状杆菌因其强大的表达能力而成为大规模生产工业相关药物和食品级化学品的广泛使用的宿主。

在这项研究中，研究人员探索了利用谷氨酸棒状杆菌作为全细胞生物催化剂产生肌酸的方法。

典型的内源性肌酸合成途径分为两步：第 1 步在肾脏中，由精氨酸和甘氨酸在甘氨酸脒基转移酶（AGAT）的催化作用下生成胍基乙酸（GAA）；第 2 步在肝脏中，S-腺苷蛋氨酸在胍基乙酸 N-甲基转移酶（GAMT）的催化作用下将 GAA 甲基化，生成肌酸。简而言之，人体依赖AGAT和GAMT这两种生物酶的催化作用，以甘氨酸、精氨酸和S-腺苷蛋氨酸为主要原料，经两步合成肌酸。

▲图 | 本研究的实验流程图（来源：上述论文）

为了将胍基乙酸酯和蛋氨酸转化为肌酸，需要将 GAMT 酶引入谷氨酸棒状杆菌。研究人员从 NCBI 上检索到Aggamt（312 bp）和Mcgamt（723 bp）的序列，构建相应的菌株。

在底物胍基乙酸和蛋氨酸浓度为 10 g/L 的条件下，全细胞生物催化反应 24 h 后进行催化反应，两种菌株分别产生 2.82±0.67 g/L 和 3.37±0.83 g/L 肌酸。因此，选择含有Mcgamt序列的菌株进一步实验。

为了提高全细胞生物催化肌酸滴度，研究人员先后测试了 9 种启动子：P1676（295bp），P1911（192bp）和P226（222bp），P2008（92bp），P0536（206bp），P0575（89bp），P1109（292bp），P0976（81bp）和P2129（95bp）。最终发现，最有效的启动子是P1676，产生 4.14±0.08 g/L 肌酸，与对照组相比，肌酸滴度增加了 22.8%。

为了进一步提高肌酸滴度，研究人员优化了全细胞生物催化反应体系，仔细研究了反应体系中的反应温度、pH 值和底物浓度（胍基乙酸和蛋氨酸），以确定使用全细胞生物催化肌酸的最佳条件。

随着 pH 值的增加，肌酸滴度也随之增加。pH8.0 下，观察到肌酸的最高滴度为 4.21±0.05 g/L。然而，pH7.0 和 8.0 之间的肌酸滴度没有显著差异；肌酸滴度也随着温度的升高而升高，在 30 °C 时达到最大值 4.14 ± 0.08 g/L。然而，温度的进一步升高显示出滴度的下降趋势；通过适当增加底物浓度，可以加快酶促反应速率，促进产物合成。肌酸滴度与胍基乙酸浓度呈正相关，在 20 g/L 的胍基乙酸浓度下达到最大值 5.07±0.06 g/L。然而，超过该浓度后，滴度随着底物浓度的进一步增加而降低。蛋氨酸也观察到类似的趋势，肌酸滴度随着蛋氨酸浓度的增加而增加，在蛋氨酸浓度为 15 g/L 时达到最大值 4.82±0.05 g/L。然而，蛋氨酸浓度的进一步增加导致肌酸滴度降低。

▲图 | 反应 pH 值、温度、胍基乙酸和蛋氨酸的底物浓度对肌酸滴度的影响（来源：上述论文）

因此，确定全细胞生物催化系统的最佳反应条件为：调节反应体系 pH 至 8.0，底物胍基乙酸浓度维持在 20 g/L，底物蛋氨酸浓度维持在 15 g/L。在恒温振荡器中，在 30 °C 和 220 rpm 下进行反应 24 小时，最大肌酸滴度为 5.42±0.05 g/L。

综上所述，本研究确立了谷氨酸棒状杆菌全细胞生物催化合成肌酸的可行性。通过外源性引入 GAMTs 和筛选强效启动子，成功产生了能够产生肌酸的重组谷氨酸棒状杆菌，为肌酸的工业规模生产提供了一种更安全、更环保的方法。

此外，文章中也指出，以蛋氨酸和胍基乙酸为底物增加了全细胞生物催化过程的经济成本。因此，有必要探索在不依赖蛋氨酸的情况下提高肌酸生物合成的效率。

素材来源官方媒体/网络新闻

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