FSHW | 羧甲基魔芋葡甘聚糖涂层对姜黄素多层乳液稳定性的影响

Introduction

姜黄素是多年生草本植物姜黄的主要活性成分。研究表明，姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、促伤口愈合和预防神经退行性疾病等功效；然而，姜黄素在功能性食品中的应用十分有限。一方面，姜黄素的分子间和分子内氢键较强，在水溶液中的溶解度和溶解速率极低；另一方面，姜黄素具有光敏性，在加工处理过程中必须注意避免降解。

为有效发挥功效，人们开发了包括传统乳液、多层乳液和多重乳液在内的以多种乳液为基础的生物活性成分递送体系，其中，通过层层自组装（LbL）制备的多层乳液被证明比传统的单层乳液更能抵抗环境压力。LbL组装技术能够通过控制涂层的特性，如组成、净电荷、层厚、透气性和环境响应性等设计乳液，所制备的乳液具有理想的静电斥力和环境斥力，以防止液滴聚集，并保护不稳定化合物免受环境应力的影响。

生物聚合物涂层极大地影响了多层乳液中荷载活性物质的稳定性、吸收率和释放模式。魔芋葡甘聚糖（KGM）是一种从魔芋块茎中提取的中性多糖，在食品工业中被广泛用作胶凝剂、增稠剂、成膜剂、稳定剂等；由于其高黏度及较好的生物降解性、成胶性和成膜性，KGM还在制药、生物技术和精细化工等行业得到广泛应用。KGM不能被上消化道的消化酶所水解，但可以被结肠菌群产生的β-甘露聚糖酶所降解。由于这种特质，KGM被广泛用结肠靶向递送体系的集成剂、涂层和骨架材料。然而，KGM本身不带电，这限制了其利用静电相互作用技术（如LbL组装）构建递送系统。

羧甲基魔芋葡甘聚糖（CMKGM）是魔芋葡甘聚糖的一种带负电荷的衍生物，与KGM具有更好的水溶性、溶胀性和稳定性。作者之前的研究显示，CMKGM与天然KGM保持着相似的对蛋白水解酶的抗性和对β-甘露聚糖酶的敏感性，并可与带相反电荷的聚电解质作用，这使得它能够通过静电相互作用构建结肠靶向递送体系。姜黄素已被用于构建结肠靶向递送系统来治疗结肠癌和炎症性肠病；KGM也已被加入到由乳清分离蛋白（WPI）乳化的姜黄素乳液中，具有可控和可持续释放的效果，然而，尚未有利用CMKGM作为涂层材料制备多层乳液用于姜黄素递送的相关研究。

在前期研究中，作者成功制备了以CMKGM为最外层的负载姜黄素的多层乳液。由于乳液在不同环境下的稳定性对其实际应用具有重要意义，本文研究了pH值、离子强度、加热、冻融和紫外照射对乳液及其负载姜黄素的稳定性的影响，并对乳液长期贮存稳定性进行评价，这为CMKGM包覆的姜黄素多层乳液在食品工业中的实际应用提供理论依据。

Results and discussion

pH值对乳液稳定性的影响

介质的pH值决定了生物聚合物的带电状态，并可能影响静电相互作用所制备多层乳液的稳定性。初级乳液粒径在pH 7.0和8.0时最小，在pH 5.0时最大，这可能与乳液的带电状态有关。在pH 3.0和4.0时，初级乳液带正电，在pH 5.0及以上时带负电，这一结果与WPI的等电点（pI）在pH 4.0~5.0的结果相一致，表明WPI成功吸附到乳液界面上。在其pI处，WPI携带的电荷最少，其静电斥力最弱，易导致乳液聚集；随着介质pH值偏离等电点，初级乳液液滴间的静电斥力增大，粒径有所减小。

在pH 4.0时，二级乳液-CMKGM的粒径最小，此时CMKGM与WPI带异种电荷；随着pH值增加到5.0，粒径急剧增大且继续增大pH，粒径基本保持不变；结合ζ电势可以推测此时CMKGM与初级乳液带同种电荷，二者结合较松散，CMKGM涂层不能完全阻止初级乳液与周围介质的接触，CMGKM从乳液中分离出来，导致乳液液滴聚集。从外观图中可以看出，在pH 3.0时二级乳液-CMKGM存在明显的乳化层，除pH 4.0外，其他pH条件下的乳液均不稳定。

对于二级乳液-CHI，pH 5.0及以下pH对其粒径无显著影响；随着pH值的增大，乳液粒径显著增大，在pH 8.0时粒径最大。在pH 6.0及更低pH条件下，二级乳液-CHI带正电，表明壳聚糖（CHI）成功吸附到初级乳液液滴表面；当pH增加到7.0和8.0时，乳液带负电，此时CHI与乳液分离，WPI暴露。从外观图中可以看出，在pH 3.0~5.0时，乳液均一稳定；当继续增大pH时，乳液出现严重的相分离现象。

在pH 3.0~8.0范围内，三级乳液的粒径均大于二级乳液-CHI，这是由于CMKGM吸附到二级乳液-CHI表面所致。三级乳液的粒径在pH 3.0~5.0时差异不显著，但在较高pH时粒径显著增加，pH 8.0时粒径最大。三级乳液在pH 6.0或更低pH条件下带正电，表明CMKGM仅部分覆盖二级乳液-CHI；当介质pH升高至7.0和8.0时，CHI去质子化，CMKGM的负电荷占主导地位。结合外观图，三级乳液在pH 3.0~6.0中均匀稳定，在pH 7.0和8.0时聚集严重。因此，三级乳液在酸性介质中的稳定性优于另外两种二级乳液，且静电作用对所有多层乳液的稳定性均起着重要作用。

图1 介质pH值对负载姜黄素的多层乳液粒径(a)、ζ电势(b)和外观(c)的影响

离子强度对乳液稳定性的影响

在食品加工过程中，通常会添加NaCl或其他盐。由于离子可以屏蔽生物聚合物之间的静电相互作用，因此研究了各种离子强度下乳液的稳定性。随着NaCl浓度的增大，各级乳液的粒径均呈现增大的变化趋势；当NaCl浓度增大到250 mmol/L时，初级乳液、二级乳液-CMKGM、二级乳液-CHI和三级乳液的粒径依次增大为原来的8.6倍、3.9倍、2.1倍及1.3倍。相比之下，随着NaCl浓度的升高，多层乳液的ζ电势仅略有下降。这表明，与pH稳定性的结果相反，NaCl的存在可能并没有使最外层聚电解质从乳液最外层脱离，而其粒径的增大可能是由于NaCl的屏蔽作用减弱了液滴间的静电斥力所致。NaCl的存在对多层乳液的外观有较大影响，在较高的NaCl浓度下，两种二次乳液表现出严重的相分离现象，而三级乳液相对稳定，所有多层乳液均未有油层析出。有趣的是，初级乳液的外观变化不明显，这与其微小的粒径变化结果相一致，这也说明静电相互作用对多层乳液的稳定性起着重要作用。

图2 NaCl浓度对负载姜黄素的多层乳液粒径(a)、ζ电势(b)和外观(c)的影响

加热对乳液稳定性的影响

将乳液分别在30 ℃、60 ℃和90 ℃水浴中孵育30 min，冷却至室温，观察其热稳定性。各级乳液的ζ电势均无明显变化，说明最外层聚电解质并未从多层乳液表层剥离。对于初级乳液而言，在30 ℃或60 ℃加热时，其粒径无显著变化，随着温度进一步升高至90 ℃，乳液粒径大幅增加，这一现象与WPI的变性和油滴的聚集有关。WPI的变性温度在78 ℃左右，30 ℃或60 ℃加热均不能诱导WPI聚集，因此不影响初级乳液的粒径。

多层乳液表现出不同的热敏感性。随着温度从30 ℃增加到60 ℃，三种多层乳液的粒径均显著增大，其中三级乳液的粒径增大最明显；随着温度进一步升高到90 ℃，多层乳液的粒径急剧减小，这可能与MCT的溶解度随温度的变化有关。结合稳定性指数，初级乳液在90 ℃加热时不稳定，稳定性指数明显降低；而对于多层乳液，虽然其粒径变化较大，但加热后稳定性指数没有显著变化，说明多层乳液具有良好的热稳定性。加热后所有乳液中姜黄素的保留率均明显减低，但CMKGM和/或CHI涂层对姜黄素提供了有效的保护，且保护效果与乳液层数呈正相关。

图3 加热对负载姜黄素的多层乳液粒径(a)、ζ电势(b)、稳定性指数(c)和姜黄素保留率(d)的影响

冻融对乳液稳定性的影响

乳液经两次冻融，即-18 ℃冷冻22 h，30 ℃解冻2 h，循环冻融两次。冻融明显增加了乳液的粒径，但对ζ电势无显著影响，这表明乳液虽发生聚集但外层生物聚合物未发生分离或离解。初级乳液、二级乳液-CMKGM、二级乳液-CHI和三级乳液在第一次冻融循环后的粒径分别比最初制备的乳液增加了5.5、3.5、2.9和1.8倍；第二次冻融循环后，除二级乳液-CHI粒径略有减小外，其余乳液粒径均增大，但多层乳液的粒径小于初级乳液；结果表明，多糖涂层提高了姜黄素乳液的冻融稳定性。经过两次冻融循环后，初级乳液顶部有油层析出，而二级和三级乳液未出现析油现象，这进一步证实了多糖涂层能够提高乳液的冻融稳定性。冻融过程中，水相中的水或油相中的荷载物质结晶可能会破坏乳液液滴的界面膜，造成乳液的聚集甚至油相析出。

随着冻融次数的增加，多层乳液中姜黄素的保留率有所降低。上述结果表明，姜黄素在冻融过程中可能会损失，但CMKGM和/或CHI包覆可提供有效的保护。生物聚合物可能通过提高水相中渗透剂的浓度降低其结晶温度，减少冰晶形成量，从而减少对乳液界面的损伤，最终改善多层乳液的冻融稳定性。

图4 冻融循环对负载姜黄素的多层乳液粒径(a)、ζ电势(b)、姜黄素保留率(c)和外观(d)的影响

紫外辐照对乳液稳定性的影响

紫外照射是食品加工过程中一种简单有效的杀菌方法。由于姜黄素对紫外光照敏感，因此测定了乳液在紫外照射下的稳定性。随着辐照时间的延长，乳液粒径均有所增大，经紫外照射72 h后，初级乳液、二级乳液-CMKGM、二级乳液-CHI和三级乳液的粒径分别增大为相应新鲜制备乳液的14.6、6.2、3.6和3.1倍；同时，多层乳液的ζ电势在紫外照射下显著降低。据报道CHI包被的磷脂-吐温80混合物稳定的姜黄素乳液在紫外辐照后粒径和ζ电势呈现类似的变化。之前的研究发现，蛋白质和CHI都能被紫外光照降解，这主要通过改变它们的官能团和电荷分布。紫外线照射在溶液中产生自由基，自由基可能氧化或与带电基团发生反应，从而“中和”位于乳液液滴表面的电荷，导致其净电荷减少，从而减弱液滴间的静电斥力，乳液发生聚集。随着紫外辐照时间的延长，各级乳液中的姜黄素保留率均显著降低，其中初级乳液中姜黄素的损失量最大。紫外辐照72 h后，游离姜黄素的保留率仅为8.9%。多糖涂层大大提高了姜黄素的保留率，其中三级乳液中姜黄素的保留率最高，其次为二级乳液-CMKGM和二级乳液-CHI，此结果表明乳液的多层结构能够有效地保护姜黄素减少紫外辐照所引起的光化学氧化。

图5 紫外照射对负载姜黄素的多层乳液粒径(a)、ζ电势(b)和姜黄素保留率(c)的影响

贮藏稳定性

将多层乳液在25 ℃下储存28 d评价其贮藏稳定性。随着贮藏时间的延长，乳液的粒径均有所增大，且初级乳液的粒径增大趋势更为明显。ζ电势的测定结果与粒径结果相一致，即多层乳液的ζ电势几乎保持不变，这为乳液液滴间提供了足够的斥力；而初级乳液的粒径从-34 mV下降到-8 mV，诱导了乳液的聚集，使乳液的粒径增大。各级乳液的稳定性指数随着贮藏时间的延长而有所降低，在贮存28 d后，初级乳液、二级乳液-CMKGM、二级乳液-CHI和三级乳液的稳定性指数分别下降到70.1%、84.7%、80.1%和86.2%。随着贮藏时间的延长，乳液中姜黄素的保留率普遍降低，贮存28 d后，游离姜黄素的损失率高达34.9%，而初级乳液、二级乳液-CMKGM、二级乳液-CHI和三级乳液中姜黄素的损失率分别为25.9%、20.9%、22.0%和16.5%。因此，多糖涂层能显著提高姜黄素的贮藏稳定性，且乳液层数越多，效果越显著。

图6贮藏时间对负载姜黄素的多层乳液粒径(a)、ζ电势(b)、稳定性指数(c)和姜黄素保留率(d)的影响

Conclusion

WPI、CHI和CMKGM之间的静电相互作用极大地影响了LbL组装法制备的姜黄素多层乳液的稳定性。在含有NaCl或酸性条件下，同种电荷的聚电解质或CHI的去质子化会导致乳液失稳。与WPI作为乳化剂所制备的姜黄素初级乳液相比，CMKGM或CHI涂层提高了芯材姜黄素在加热、紫外辐照、冻融或长期贮藏条件下的保留率，尤其是在前两种环境应力下，由于乳液界面层的屏障作用，其提高效果显著，但在二级乳液-CHI外层添加CMKGM涂层，能够进一步增强其保护效果。因此，多层乳液在酸性环境、高温杀菌或冷藏的配方中均可应用，其作为构建姜黄素递送载体的递送效果还应通过细胞实验和体内动物研究来进一步验证。

作者简介

第一作者

王鲁慧，女，工学硕士，现为中国海洋大学食品科学与工程学院在读博士研究生，主要研究方向为食品配料稳态化技术，目前以第一或共一作者在Food Hydrocolloids、Food Chemistry、International Journal of Biological Macromolecules、Food & Function、《食品科学》、《中国食品学报》等国内外期刊公开发表多篇学术论文。

通信作者

石嘉怿，女，南京财经大学食品科学与工程学院教授，硕士生导师。近年来从事粮油质量安全方面的研究工作，主要致力于稻谷加工及贮藏过程中质量控制、粮油中生物活性物质的功能评价及其相互作用的研究等。主持国家自然科学基金，科技部“十三五”国家重点研发计划子课题、江苏省前瞻性联合研究等项目，发表文章60余篇，主编或参编（参译）5部教材。

Effect of carboxymethyl konjac glucomannan coating on curcumin-loaded multilayered emulsion: stability evaluation

Luhui Wanga,b, Xinru Zhanga, Junxia Xiaoa,*, Jiayi Shic,*

aCollege of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China

bCollege of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266109, China

cCollege of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance & Economics, Nanjing 210023, China

*Corresponding author.

Abstract

The stability against various environmental stresses of the curcumin-loaded secondary and tertiary emulsions that was emulsified by whey protein isolate (WPI) and coated by chitosan (CHI), carboxymethyl konjac glucomannan (CMKGM), or their combination through layer-by-layer assembly was investigated. Generally, the multilayered emulsions were destabilized in high NaCl concentrations or medium pH that could interrupt the electrostatic interaction between the three polyelectrolytes or deprotonate CHI, indicating that electrostatic interaction played an important role in the stability of emulsions. Compared with the primary emulsion that was solely stabilized by WPI, extra coating with CHI and CMKGM generally increased the stability of the emulsion against repeated freezing-thawing, improved the retention of curcumin against heating, UV irradiation, and long-term storage, and the effects were more remarkable in the tertiary emulsion with CMKGM locating in the outmost layer. Since CMKGM has shown the colon-targeted delivery potency, the multilayered emulsions assembled by layer-by-layer deposition, especially the tertiary emulsion, could be used as an effective carrier for the targeted delivery of curcumin.

Reference:

WANG L H, ZHANG X R, XIAO J X, et al. Effect of carboxymethyl konjac glucomannan coating on curcumin-loaded multilayered emulsion: stability evaluation[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(2): 555-563. DOI:10.1016/j.fshw.2022.07.058.

文章编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅

Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

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