王锋团队报道双硫仑介导T细胞信号及抗肿瘤效应的机制

肿瘤免疫治疗是继手术、化疗和放疗之后被公认为最有潜力的肿瘤治疗策略【1】。CD8+ T细胞作为肿瘤免疫治疗中发挥重要作用的淋巴细胞，其T细胞受体（TCR）对肿瘤抗原的识别并介导下游信号通路的活化是CD8+ T细胞发挥抗肿瘤免疫的先决条件。但是，在肿瘤免疫微环境中CD8+ T细胞往往处于抑制状态从而介导肿瘤的免疫逃逸【2】。因此，寻找能够安全高效活化CD8+ T细胞的药物是临床肿瘤免疫治疗的重要策略之一。

2022年5月31日，上海交通大学医学院王锋课题组在The EMBO Journal发表了题为Disulfiram bolsters T cell anti-tumor immunity through direct activation of LCK-mediated TCR signaling的研究论文。该论文首次报道了，一种FDA批准的药物双硫仑（Disulfiram，DSF）可以通过共价结合并激活LCK激酶活性，从而活化T细胞受体（TCR）胞内段ITAMs磷酸化，进而介导T细胞信号及抗肿瘤效应功能。

DSF是一种乙醛脱氢酶抑制剂，因为其卓越的安全性和有效性，已在临床抗酗酒治疗应用了60多年【3】。自二十世纪末以来，越来越多的证据揭示了DSF及其代谢产物的抗肿瘤活性，但对其在T细胞抗肿瘤免疫反应的作用仍未可知【4】。研究人员通过构建T细胞受体信号筛选体系，从对1835个小分子中筛选分析发现到DSF显著促进TCR信号下游信号分子S6的磷酸化。在进一步验证筛选的实验中，作者意外的发现，在没有经典的TCR crosslinking（anti-CD3+CD28）刺激的情况下，DSF就能够直接激活TCR信号。鉴于NFAT是T细胞TCR信号活化后下游负责T细胞活化的重要转录因子，作者发现DSF在有TCR表达的细胞中能够直接激活NFAT的转录活化，但是在TCR表达缺失的细胞中DSF不能影响NFAT的转录活性。这些结果表明，提示DSF以TCR依赖的方式直接激活其下游信号通路。

紧接着，研究人员探索了DSF在T细胞的直接作用靶点。MST和DARTS结果表明，DSF通过共价结合的形式直接结合LCK的N端Cys20／23位点。LC-MS结果显示，DSF一半的对称结构能够直接与LCK的Cys23位的巯基结合，形成dithiodiethylcarbamoyl adduct。进一步实验结果表明，DSF结合直接激活LCK的激酶活性，并显著促进LCK活性微簇（microcluster）的聚集和稳定。体外实验证明，DSF活化的LCK激酶介导TCR-CD3胞内段ITAMs的磷酸化。当在Jurkat细胞系中敲除LCK后，DSF失去了对TCR-CD3复合体的激活作用，回补LCK后，DSF重新获得对TCR信号的活化作用，而当回补 LCK(C20/23S)突变后，DSF仍然不能激活TCR信号。这些结果表明，DSF通过直接结合LCK N端的Cys20和Cys23位点，激活其激酶活性，从而活化TCR信号通路。

TCR信号活化能够引发一系列的T细胞活化效应，主要表现为细胞增殖和效应细胞因子的产生等。为了进一步探究DSF对CD8+ T细胞活化的影响，作者使用DSF处理CD8+ T细胞，RNA-Seq分析发现DSF处理CD8+ T细胞中TCR信号通路及代谢相关通路均有显著富集。与对照组相比，DSF处理后的CD8+ T细胞中与T细胞活化相关的基因表达水平均显著上调。进一步对细胞因子产生和增殖水平检测结果显示，DSF显著促进CD8+ T细胞IL-2，IFN-γ和TNF-α的产生以及T细胞的增殖。鉴于RNA-Seq结果提示DSF处理后，CD8+ T细胞中与代谢相关通路也有明显富集，且代谢重编程也是T细胞活化的一个重要指标，因此作者使用Seahorse实验进行验证，结果发现，DSF处理后的T细胞代谢水平显著高于对照组。以上结果表明，DSF直接促进T细胞增殖，IL-2等效应细胞因子的产生以及代谢重编程的发生（图1）。

图1 DSF活化T细胞的分子机制模式图

动物体内实验表明，DSF显著抑制多种实体肿瘤生长并提高生存率。取TILs进行流式和免疫荧光分析发现，DSF灌胃组的小鼠，其CD8+ T细胞比例和数量、CD8/CD4比例、IFN-γ和GzmB阳性CD8+ T细胞的比例和数量均显著高于对照组。DSF与PD-1抗体联用进一步抑制小鼠黑色素瘤的生长并提高生存率。为了探究DSF的抗肿瘤效应是否依赖于CD8+ T细胞，作者在黑色素瘤荷瘤小鼠体内使用CD8抗体清除CD8+ T细胞，结果表明，当耗竭CD8+ T细胞以后，DSF对小鼠黑色素瘤的抑制作用显著减弱，提示DSF体内的抗肿瘤作用依赖于CD8+ T细胞。体外肿瘤细胞与T细胞共培养实验结果表明，DSF处理后的CD8+ T细胞，其对肿瘤细胞的杀伤水平显著高于对照组。进一步的T细胞体内回输实验表明，与对照组相比，DSF预处理过的CD8+ T细胞，回输到荷瘤小鼠体内以后，显著抑制小鼠黑色素瘤的生长，并提高其生存率。这些结果都表明，DSF通过激活CD8+ T细胞进而发挥强效抗肿瘤功能，提示其作为肿瘤免疫治疗候选药物的巨大潜力。

该研究报道了DSF是一种高效且广谱的T细胞激活小分子化合物，首次揭示并系统的阐明DSF在T细胞中的直接作用靶点、信号活化机制以及依赖于T细胞的抗肿瘤效应等。DSF本身作为临床上使用60多年的抗酗酒药物，具有非常优越的安全性，因此本工作可以指导DSF的肿瘤临床实践，或进一步开发相关的抗肿瘤免疫药物，为DSF的“老药新用”和开发新的临床T细胞肿瘤免疫治疗方案提供了可靠的依据和坚实的理论基础。

上海交通大学医学院上海市免疫学研究所王锋研究员为论文通讯作者，王秦兰博士后、朱婷和缪乃俊助理研究员为论文的共同第一作者。

https://www.embopress.org/doi/abs/10.15252/embj.2022110636

制版人：十一

参考文献

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