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黄瓜是重要的蔬菜作物，其花具有性别类型的多样性，如雌花，雄花和两性花；同时其植株也具有性别系统的多样性，如雌雄同株，全雌株，全雄株，强雄珠，全两性花株等（图1）。此外，环境因素和激素处理，如光温变化、乙烯、赤霉素、生长素等，都会改变其性别分化。丰富而又可变的性别类型，使得黄瓜成为研究植物性别决定的重要模式植物。
图1 黄瓜花的性别类型（左）与植株的性别类型（右）
黄瓜的性别类型主要由CsACS1G（Fgene， 全雌基因）、CsACS2（Mgene，两性花基因）和CsACS11（Agene，全雄基因）等ACC合成酶控制，这些基因具有明确的表型和遗传关系。早在2005年，上海交大黄瓜育种团队就开始对黄瓜两性花与雌花的性别决定机制进行探索（与黄三文团队合作）。通过构建遗传图谱，在还不具备黄瓜参考基因组的情况下，利用BAC文库和染色体步移方法，成功定位并克隆了黄瓜单性花基因M，即CsACS2基因（Li et al., Theor Appl Genet, 2008; Li et al., Genetics, 2009）。由于CsACS2外显子中的G→T非同义突变，导致其催化活性的丧失，使得雌花雄蕊无法受到抑制，进而表现为两性花（图2）。
图2 利用BAC文库进行染色体步移，鉴定出CsACS2的突变导致两性花的产生
为进一步研究为什么CsACS2的突变导致两性花的产生，Li等通过对CsACS2启动子的克隆与活性分析，鉴定其对乙烯信号的响应，并提出基于CsACS2的正反馈调控模型（图3）。该模型认为，CsACS2首先响应上游乙烯信号而表达，进而进一步合成乙烯，造成花芽发育初期产生局部高浓度、长时期的乙烯信号，从而抑制两性花芽的雄蕊，促进子房发育，最终形成单性雌花（Li et al., J EXP BOT, 2012）。
图3 CsACS2的正反馈调控模型
随着高通量测序的兴起，团队利用转录组测序方法，对在不同性别类型（全雌型、强雄型和全两性花型）植株中的差异表达基因进行鉴定。通过对差异基因的筛选和分析，鉴定出几个重要基因可能参与雌花的分化与发育。在这些基因中，CsERF31在表达模式和分子功能上表现出与CsACS2基因极高的相关性，因此推测其可能为具有介导正反馈调控和调控下游雌花分化的重要功能（Pan et al., Frontiers in Plant Science, 2018）。
为进一步解析乙烯正反馈调控在黄瓜雌花分化中的生物学意义与分子机制，Pan等对CsERF31的分子功能进行了一系列分析。研究结果于2021年3月21日发表于Plant Physiology，揭示了乙烯介导黄瓜雌花分化的分子机制。作者首先通过RNA原位杂交检测到CsERF31特异在雌雄蕊原基中表达；以GUS为报告基因证实CsERF31启动子响应乙烯信号；同时，利用蛋白-DNA互作研究手段，发现CsERF31受上游CsEIN3蛋白调控，进而激活下游CsACS2的表达；通过构建功能获得和功能缺失的CsERF31转基因植株，证明其表达水平的决定了花芽分化为雌花还是两性花。最终提出了由“CsERF31-CsACS2”介导的乙烯正反馈循环，促使黄瓜雌花而非两性花分化的分子机制（图4）。
图4 “CsERF31-CsACS2”介导的黄瓜雌花分化的分子机制
在黄瓜性别决定过程中，由尚未知晓的途径产生初始的乙烯信号，决定花芽将分化为雌花而非雄花。同时，初始的乙烯信号（图中黑色C2H4）通过CsEIN3介导的乙烯信号传导途径，激活CsERF31的表达。CsERF31进一步激活CsACS2的表达，从而产生更高浓度的乙烯（红色乙烯）。这一过程中，CsERF31的高水平表达直接或间接调控下游花发育基因，抑制雄蕊，促进雌蕊发育，从而形成雌花而非两性花。如果该循环中CsACS2的功能丧失，将导致无法形成正反馈调控，CsERF31处于较低的表达水平，无法抑制雄蕊和促进雌蕊，形成两性花。而在没有上游乙烯信号情况下，CsERF31的表达无法被激活，所以花芽分化为雄花。
综上所述，该团队在多年的研究中，始终聚焦于单性花-两性花决定基因CsACS2，从图位克隆和表达模式分析，到分子互作与生物学功能鉴定，逐步解析了“乙烯促雌”的分子机制，为进一步探索黄瓜单性花的分化与演化过程提供参考。
作者与团队介绍
上述论文通讯作者为上海交通大学农业与生物学院蔡润，潘俊松教授。其中，CsACS2的图位克隆与正反馈模型提出相关论文第一作者为李征（教授，西北农林科技大学园艺学院），共同第一作者包括黄三文（研究员，中国农业科学院农业基因组研究所）和刘世强（副教授，江西农业大学生物科学与工程学院）。CsERF31的鉴定与调控机制相关论文第一作者潘健，现为上海交通大学农业与生物学院博士后，共同第一作者温海帆为该单位博士研究生。该系列研究受到国家自然科学基金委、上海市科委、上海市农委等的项目支持。
上海交通大学黄瓜分子育种团队，由蔡润教授1997年建立，主要通过正向遗传学方法对黄瓜重要农艺性状基因进行克隆与应用。蔡润团队在二十余年的研究过程中，通过分子辅助育种方法培育10多个黄瓜新品种并大范围推广，先后获得教育部技术发明一等奖，上海市科技进步一、二、三等奖。同时，利用多年收集的种质资源，聚焦于黄瓜性别决定、果实刺瘤分化和白粉性抗性基因鉴定等研究方向，奠定了扎实的遗传与分子基础。
图5 蔡润团队成员2009年（左）和2017年合影（右）
参考文献
1、 Development and fine mapping of three co-dominant SCAR markers linked to the M/m gene in the cucumber plant.
https://doi.org/10.1007/s00122-008-0859-3
2、 Molecular Isolation of the M Gene Suggests That a Conserved-Residue Conversion Induces the Formation of Bisexual Flowers in Cucumber Plants.
https://doi.org/10.1534/genetics.109.104737
3、 A putative positive feedback regulation mechanism in CsACS2 expression suggests a modified model for sex determination in cucumber.
https://doi.org/10.1093/jxb/ers123
4、 Differential Gene Expression Caused by the F and M Loci Provides Insight Into Ethylene-Mediated Female Flower Differentiation in Cucumber.
https://doi.org/10.3389/fpls.2018.01091
5、 ETHYLENE RESPONSE FACTOR31 mediates a positive feedback loop that initiates female cucumber flower development.
https://doi.org/10.1093/plphys/kiab141
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