如何防止 T 细胞过度抑制？北大王嘉东/王巍/申占龙 PNAS 揭示 PD-1 稳态调控机制

　　詹姆斯艾利森（James P. Allison）（CTLA-4 抑制） 与本庶佑（Tasuku Honjo）（PD-1 抑制） 分享了 2018 年尔生诺贝理学或医学奖，以表彰他们「发现负性免疫调节治疗癌症的疗法方面的贡献」。程序性死亡受体 1（PD-1）及其配体 PD-L1 是最有前途的靶点之一，目前抗 PD-1/PD-L1 单抗（O药、K药等）已成功用于抗击多种恶性肿瘤。

　　PD-1 作为重要的免疫检查点，表达在活化的 T 细胞表面并转导免疫抑制信号，因此能显著地抑制肿瘤特异性免疫应答。PD-1 的表达在多个水平上受到高度调节，包括受到各种转录因子和信号通路的调节，例如活化蛋白 1 （AP1） 、T-bet、Notch 等；但是，目前科学界对 PD-1 蛋白在翻译后水平的动态调节所知甚少。

　　2020 年 10 月 27 日，北京大学基础医学院王嘉东教授和王巍教授、北京大学人民医院胃肠外科申占龙教授团队在PNAS杂志上在线发表了题为 KLHL22 maintains PD-1 homeostasis and prevents excessive T cell suppression 的研究成果。该研究发现 KLHL22 通过降解不完全糖基化的 PD-1 来维持 PD-1 蛋白的动态平衡，从而防止 T 细胞的过度抑制。

　　KLHL22 介导的 PD-1 蛋白降解对肿瘤微环境或 5-FU 治疗无效，导致 PD-1 积累过多和 T 细胞活性降低。

　　图片来源：PNAS

　　研究内容

　　KLHL22 是 PD-1 相关的主要蛋白

　　为了探索 PD-1 在蛋白质水平的调控因子，作者首先对稳定表达 PD-1-FLAG 的 Jurkat 细胞进行了质谱分析，并对稳定表达 PD-1 的 HEK293T 细胞进行了串联亲和纯化，结果发现KLHL22（BCR E3 泛素连接酶的一种底物特异性衔接子）被鉴定为与 PD-1 主要相关，在 576 种鉴定蛋白中排名第 19 位（排名前 3.30％）。

　　同时，来自 HEK293T 细胞的鉴定结果显示 KLHL22 仍名列前茅，在 186 种蛋白质中排名第 22 位。不仅如此，KLHL22 是唯一在两种鉴定结果中覆盖率均大于 10％的蛋白质。BCR 的 E3 泛素连接酶 KLHL22 竟是与 PD-1 相关的主要蛋白，这引起研究者的注意。

　　KLHL22 的缺失导致 PD-1 在蛋白质水平上调

　　基于以往 KLHL22 相关研究成果（即 KLHL22 是 E3 泛素连接酶的特异性衔接子）以及 E3 连接酶的功能 （即特异性识别底物并靶向其进行泛素化，泛素化蛋白质最后通过蛋白酶体途径降解） ，作者首先研究了KLHL22 是否靶向降解 PD-1。

　　体外实验发现 Jurkat 细胞中短发夹 RNA （shRNA） 介导的 KLHL22 敲降确实导致细胞表面 PD-1 水平增高。作者进一步通过 KLHL22 基因敲除（KO）小鼠进行体内验证，结果发现 KLHL22 KO 小鼠中 CD8+T 细胞和 CD4+T 细胞表面 PD-1 水平也都增加。因此，KLHL22 下调会导致 PD-1 蛋白质水平增加，这也说明 KLHL22 是 PD-1 的 E3 连接酶衔接子，介导其降解。

　　KLHL22 在 PD-1 转运到细胞表面之前介导 PD-1 降解

　　接下来作者探讨了 PD-1 在哪个阶段被 KLHL22 降解。作者初步探索发现 KLHL22 KO 不影响 PD-1 的 mRNA 水平，因而排除了 KLHL22 在转录水平降解 PD-1 的可能性；而且 KLHL22 不会出现在细胞膜上，无论 T 细胞活化状态如何。作者由此推断PD-1 可能在转运到细胞膜表面之前被 KLHL22 识别并降解。

　　于是作者使用了布雷菲德菌素 A （BFA，可以抑制蛋白质从内质网转运至高尔基体） 处理细胞，发现 PD-1 出现了不完全糖基化的低分子量条带，用 BFA 和 E3 泛素连接酶抑制剂 MLN4924 同时处理导致更高水平的不完全糖基化 PD-1。重要的是，在 KLHL22 表达缺乏的情况下，不完全糖基化的 PD-1 的积累量大于完全糖基化的 PD-1 的积累量。

　　这些结果表明 PD-1 可以在完全成熟并到达细胞表面之前被 KLHL22 降解。为了进一步验证这种现象，作者从 KLHL22 KO 和 WT 小鼠的 CD3+T 细胞中摘除高尔基体、清除细胞膜上的成熟 PD-1 后，发现 KLHL22 KO 细胞中的不完全糖基化 PD-1 量要比 WT 细胞中的高，这表明 KLHL22 在 PD-1 完全糖基化并转移到细胞表面之前介导了 PD-1 降解。

　　KLHL22/CUL3/RBX1 介导体内 PD-1 泛素化

　　作者进一步测试 PD-1 的泛素化发现 KLHL22 敲降显著降低 PD-1 泛素化水平。有趣的是，不完全糖基化的 PD-1 的泛素化水平高于成熟的 PD-1，而 MLN4924 减弱了不完全糖基化的 PD-1 的泛素化。此外，作者发现KLHL22/CUL3/RBX1 复合体显著增加了 PD-1 泛素化水平并促进其降解。

　　KLHL22 通过降解 PD-1 增强肿瘤免疫力

　　基于 PD-1 在肿瘤免疫抑制的关键作用，作者进一步通过皮下黑素瘤和结直肠癌（CRC）小鼠模型来探索 KLHL22 在肿瘤免疫中的作用。研究发现接种肿瘤的 KLHL22 KO 小鼠比 WT 小鼠肿瘤进展更快且和总存活期更短。

　　KLHL22 缺乏症不影响肿瘤微环境中 CD8 + 和 CD4+T 细胞的比例或 Treg 细胞的百分比。然而，在 KLHL22 KO 小鼠中，肿瘤浸润性 CD8 + 和 CD4+T 细胞表面上的 PD-1 水平显著高于 WT 小鼠，产生效应细胞因子 IFN-γ，TNF 和颗粒酶 B 的肿瘤浸润性 CD8 + 和 CD4+T 细胞的数量也明显减少。KLHL22 KO 小鼠和 CD8+T 细胞的增殖也受到损害。

　　总之，这些结果表明KLHL22 缺乏可能通过上调 PD-1 表达导致肿瘤浸润性 T 细胞过度抑制。

　　T 细胞激活信号和肿瘤微环境调节 KLHL22 表达

　　基于 PD-1 表达是 T 细胞受体激活后显著上调这一以往研究成果，作者接下来探索了 KLHL22 是否也可能受 TCR 激活信号调节以维持 T 细胞稳态，结果发现，在 T 细胞活化后 KLHL22 mRNA 水平显著增加。因而，通过 T 细胞激活信号上调 KLHL22 表达可以维持 PD 水平在适当范围。随后作者观察到与正常组织浸润性 T 细胞相比，CRC 患者的肿瘤浸润性 T 细胞中 KLHL22 蛋白水平显著降低。这说明KLHL22 同样受肿瘤微环境调控：下调 KLHL22 表达导致 PD-1 水平增高。

　　5-FU 通过抑制 KLHL22 转录增加 PD-1 表达

　　有大量的临床和实验证据表明，PD-1 单克隆抗体与化疗相结合比单独化疗具有更好的疗效，但其机制尚不完全清楚。以往研究表明与其他化疗药物相比，5-FU 可以显著增加 PD-1 的表达。因此，作者探索了化疗药物（如 5-FU）是否可能调节 KLHL22 水平并影响 PD-1 的表达。

　　研究结果发现 5-FU 在转录水平上特异性下调了 KLHL22 表达，而且 5-FU 增强了 PD-1 的表达但没有增加其 mRNA 水平。另外，在 WT 小鼠中进行 5-FU 处理后，T 细胞中的 PD-1 表达增加，而在 KLHL22 KO 小鼠中则没有。这进一步说明了下调 KLHL22 在 5-FU 介导的 PD-1 表达增加中起关键作用。

　　研究总结

　　本研究中发现 E3 泛素连接酶 KLHL22 调控 PD-1 的内稳态。KLHL22 识别不完全糖基化的 PD-1，并在 PD-1 转运到细胞表面之前通过蛋白酶体途径介导其降解。

　　T 细胞活化后，KLHL22 被上调，从而控制细胞表面上 PD-1 的量并维持其稳态，从而防止了 T 细胞的过度抑制。在 KLHL22 缺乏或失调的条件下，例如来自肿瘤微环境的因素和用 5-FU 治疗，过量的 PD-1 积累则会抑制 T 细胞活性。

　　这一发现完善了细胞内 PD-1 蛋白质在翻译后水平的动态调节机制，并且为 PD-1 单克隆抗体与 5-FU 结合治疗方案提供了理论基础。该成果探讨了KLHL22 在肿瘤微环境中的作用，作者表示未来的工作将集中在 KLHL22 的调控及其在慢性炎症中的作用。

　　另外，本研究仍启发更多可以探索的问题：1. 尽管已确认 5-FU 在转录水平上影响 KLHL22，但是具体机制仍不清楚；2. 除了 KLHL22 负责 PD-1 的调节外，还可能有其他潜在机制需要完善；3.PD-1 过度积累是否是导致 KLHL22 KO 小鼠肿瘤进展更快的唯一因素仍需进一步研究。

　　北大基础医学院官网：http://sbms.bjmu.edu.cn/jsdw/bssds/dsjs/132526.htm

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