婴儿粪便长双歧杆菌的分离与多样性分析

双歧杆菌（Bifidobacterium）作为肠道有益微生物在保持机体健康方面起重要作用，母乳喂养的婴儿肠道中双歧杆菌占优势，但是不同个体双歧杆菌种类差异较大。传统的生理生化和16SrDNA同源性分析对亲缘关系比较近的物种分辨率不高，而高度保守的热应激蛋白60（hsp60）基因，在双歧杆菌亲缘物种鉴定方面则可以提供更为准确的信息。随机扩增多态性DNA（RAPD）是研究多样性经常采用的方法，与之相比多位点序列分型（MLST）技术可以更为准确地区分分离株的基因型，提供更多的基因信息。

来自东北农业大学乳品科学教育部重点实验室的张秋雪、刘晓婵、朱宗涛等拟采集3～6 个月纯母乳喂养婴儿粪便，采用纯培养技术分离其中的长双歧杆菌，进一步利用16SrDNA、hsp60、RAPD和MLST技术分析分离得到的长双歧杆菌多样性，为深入研究长双歧杆菌在婴儿健康中的作用和功能提供理论支持。

分离菌株形态及生理生化实验结果

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分离菌株的菌落菌体形态

从11 个健康母乳喂养的婴儿粪便中分离得到18 株疑似菌株。菌落乳白色或白色、凸起、光滑且边缘水润。18 株菌均为革兰氏染色阳性，菌体排列不规则，菌体形态为杆状，且杆状末端分叉，呈V或Y字、顿圆、哑铃等形态。

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生理生化实验结果

18 株分离株均为专性厌氧菌，过氧化氢酶实验、明胶液化实验、氧化酶实验、吲哚实验、硝酸盐还原实验均为阴性，无运动性。

分离菌株的基因同源性分析

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16S rDNA同源性

18 株分离株PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，在1 500 bp左右处有明亮单一条带，满足测序要求。有10 株菌与长双歧杆菌的同源性均达到99%。其余8 株分别为两歧双歧杆菌2 株、假小连双歧杆菌1 株、动物双歧杆菌乳酸亚种4 株、短双歧杆菌1 株。

构建系统发育树，发现有7 株菌（H3-R1、H9-5、H10-1、H16-2、H20-14、H27- 10、H27-13）均与长双歧杆菌长亚种ATCC15707 16S rDNA亲缘关系最近，初步确定为长双歧杆菌长亚种；3 株菌（H5-19、H5-21、H11）与长双歧杆菌婴儿亚种 ATCC15697 16S rDNA亲缘关系最近，初步确定为长双歧杆菌婴儿亚种。

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hsp60同源性分析

10 株长双歧杆菌的hsp60基因PCR扩增后电泳，在650 bp左右处均有明亮单一条。构建无根进化树，发现7 株菌（H3-R1、H9-5、H10-1、H16-2、H20-14、H27-10、H27-13）与长双歧杆菌长亚种JCM1217的亲缘关系最近，并结合以上结果判定为长双歧杆菌长亚种；3 株菌（H5-19、H5-21、H11）与长双歧杆菌婴儿亚种 JCM1222的亲缘关系最近，并结合以上结果判定为长双歧杆菌婴儿亚种。

长双歧杆菌多样性的分析

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RAPD分析结果

不同引物的扩增片段数目为1～7 条之间，片段分子质量大小在0～1 kb之间。综合4 个随机引物的扩增图谱可知，长双歧杆菌H3-1、H9-5、H10-1、H20-14、H16-2、H11分别具有差异条带图谱，属于不同株型；H27-10和H27-13、H5-19和H5-21具有相同条带图谱，属于同一株型。

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MLST的分析结果

（1）等位基因电泳及测序

选取7 个等位基因，运用设计好的等位基因引物对长双歧杆菌等位基因扩增。10 株长双歧杆菌的7 个等位基因均扩增成功，且有明亮单一条带，满足测序要求送样品进行测序。

（2）长双歧杆菌的等位基因分型

将10 株长双歧杆菌分为8 个ST型，且均与ATCC15707为不同的ST型。7 株长双歧杆菌长亚种分为6 个基因型，其中菌株H3-R1、H9-5、H10-1、H20-14、H16-2分别属于不同ST型，而菌株H27-10和H27-13属于同一ST型。3 株长双歧杆菌婴儿亚种分为2 个基因型，其中H5-19和H5-21属于同一ST型，且与H11为不同ST型。

（3）长双歧杆菌等位基因系统发育树构建

分离于H5婴儿个体的H5-19和H5-21菌株为相同ST型，分离于H27婴儿个体的H27-10和H27-13号菌株为相同ST型。

结 论

本研究从11 个健康婴儿体内分离鉴定得到10 株长双歧杆菌，7 株为长双歧杆菌长亚种，3 株为长双歧杆菌婴儿亚种。多态性分析发现：7 株长双歧杆菌长亚种为6 个基因型，3 株长双歧杆菌婴儿亚种为2 个基因型，说明婴儿肠道中长双歧杆菌存在较大的遗传多样性。

本文《婴儿粪便长双歧杆菌的分离与多样性分析》来源于《食品科学》2017年38卷24期8-14页，作者:张秋雪，刘晓婵，朱宗涛，万 峰，孙思睿，贾芳芳，孟祥晨。DOI:10.7506/spkx1002-6630-201724002。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改: 《食品科学》通讯员 江西师范大学瑶湖校区生命科学学院 袁媛

编辑：袁艺；责任编辑: 张睿梅

图片来源于百度图片

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