药物免疫原性研究技术指导原则：体外细胞因子释放试验核心内容

根据《药物免疫原性研究技术指导原则》，体外细胞因子释放试验是药物免疫原性研究的重要组成部分，是评估药物潜在免疫相关安全风险的关键体外试验方法，可为药物非临床安全性评价及临床研究设计提供科学依据。以下是该指导原则中关于体外细胞因子释放试验的核心内容，结合试验设计、操作要求及结果解读进行系统梳理，确保内容完整、逻辑严谨。

一、试验目的

体外细胞因子释放试验的核心目的是评估药物在体外条件下，是否可能诱发机体免疫细胞异常释放细胞因子，进而预测药物在临床应用中可能引发的细胞因子释放综合征（CRS）及其他免疫相关不良反应。尤其针对直接靶向免疫细胞（如T细胞、B细胞、巨噬细胞等）、具有免疫激动作用，或可能通过免疫交联、受体激活等方式触发免疫细胞活化的药物，该试验可早期识别潜在临床安全风险，为药物后续研发及剂量选择提供参考。

图1. TGN1412体外细胞因子释放试验的6种模型

二、试验设计

试验设计需遵循科学性、合理性及可重复性原则，结合药物的作用机制、临床应用场景，明确细胞选择、药物作用模式、浓度范围及对照设置等关键要素，确保试验结果的可靠性和临床相关性。

（一）细胞选择

优先选用人外周血单个核细胞（PBMC）或人全血作为效应细胞，两种细胞各有优势，可根据药物作用机制单独选择或联合使用。其中，PBMC经分离纯化后，免疫细胞纯度高，对药物刺激的反应更敏感，适合用于精准检测药物对特定免疫细胞亚群的激活作用；人全血保留了体内生理状态下的细胞间相互作用及血浆成分，更贴近药物在体内的实际作用环境，可更真实地反映药物诱导的细胞因子释放情况。若药物作用靶点为特定免疫细胞亚群（如T细胞），也可选用纯化的该类细胞进行试验。

（二）药物作用模式

需结合药物在体内的作用方式，设计合理的体外作用模式，以充分模拟药物与免疫细胞的相互作用过程。常用的作用模式包括液相作用、湿法包被、干法包被等：液相模式适用于可溶性药物，模拟药物在体内血液、体液中与免疫细胞的游离结合；包被模式（湿法、干法）适用于靶向细胞表面受体的药物（如抗体类药物），可模拟药物与细胞表面受体的特异性结合，以及可能出现的多价交联作用，更贴合药物在体内的靶向作用特征。试验中可根据药物的剂型、作用靶点及结合方式，选择一种或多种作用模式进行验证。

（三）浓度范围

药物测定浓度需覆盖临床相关浓度范围，同时兼顾体外试验的敏感性和可行性。一般情况下，药物浓度设置在0.25μg/mL至10μg/mL之间，可根据药物的预期临床剂量、体内药代动力学特征及体外细胞敏感性进行调整。对于临床剂量较高或体外反应较弱的药物，可适当扩大浓度范围；对于毒性较强的药物，需合理设置浓度梯度，避免细胞过度损伤影响试验结果。浓度梯度设置应遵循等比或等差原则，至少包含3个浓度点，确保能清晰反映药物浓度与细胞因子释放量的量效关系。

（四）对照设置

为验证试验系统的可靠性、排除非特异性反应，试验需严格设置阳性对照、阴性对照，必要时可设置空白对照，各类对照的设置需符合指导原则要求：

• 阳性对照：选用已知可有效诱导细胞因子释放的物质，常用CD3抗体OKT3、CD28超级激动剂TGN1412等，用于验证试验细胞的活性及检测系统的敏感性，确保试验体系可正常检测到细胞因子释放反应。
• 阴性对照：包括溶媒/载体对照及同型对照（针对抗体类药物）。溶媒/载体对照用于排除药物溶媒、载体本身对细胞因子释放的影响；同型对照用于排除抗体类药物的非特异性结合对试验结果的干扰，确保试验结果是药物特异性作用的体现。
• 空白对照：必要时设置，即不加入药物、仅加入细胞及培养体系的对照，用于排除培养体系本身对细胞因子释放的影响。

三、检测指标

细胞因子检测需选择与CRS及免疫激活相关的核心指标，兼顾特异性和敏感性，通常检测的细胞因子包括白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-10（IL-10）等。其中，IL-6、TNF-α是CRS的关键标志性细胞因子，IL-2、IFN-γ主要反映T细胞活化状态，IL-10则作为抗炎细胞因子，可辅助判断免疫反应的平衡状态。

检测方法需确保灵敏度、准确性及可重复性，常用方法包括Luminex（多因子检测）、MSD（多因子检测）、ELISA（酶联免疫吸附试验）等。Luminex、MSD方法可同时检测多种细胞因子，灵敏度高、检测范围广，适合多指标联合检测；ELISA方法特异性强、操作简便，适合单一指标的精准检测，可根据试验需求选择合适的检测方法。检测过程中需设置标准曲线，严格按照试剂盒说明书操作，确保检测结果的可靠性。

四、试验要求

为保障试验结果的科学性和可靠性，试验需严格遵循以下要求，同时结合药物特性灵活调整：

（1）细胞样本要求：至少使用3个不同供体的细胞样本，供体选择需考虑年龄、性别、健康状况等因素，避免个体差异对试验结果的影响；若药物针对特定人群（如老年人、儿童），可适当增加对应人群的供体样本，提高试验结果的临床相关性。细胞分离、培养过程需严格遵循无菌操作原则，确保细胞活性及纯度。

（2）试验重复性要求：每个浓度梯度及对照均需设置复孔（通常3-4个复孔），试验需至少重复2次，确保试验结果的可重复性；若复孔间差异较大（如CV值超过15%），需分析原因并重新进行试验。

（3）结果分析要求：试验结果需结合药物作用机制、体内试验数据及临床研究信息进行综合分析，不可单独依据体外试验结果下结论。当体内试验结果为阴性时，体外试验阳性结果可提示药物存在潜在临床安全风险，需进一步优化试验方案或开展后续验证试验；当体外试验结果为阴性时，可在一定程度上降低药物引发CRS的风险，但仍需结合临床数据进行综合评估。

五、试验意义与注意事项

该指导原则强调，体外细胞因子释放试验是药物非临床安全性评价的重要补充，也是药物首次人体临床试验（FIH）剂量选择的重要依据之一。通过该试验，可早期识别药物潜在的免疫相关安全风险，优化药物研发方案，降低临床研究风险。

试验过程中还需注意以下事项：一是需根据药物的作用机制和风险特征，设计个性化的试验方案，避免照搬通用方案；二是试验所用试剂、仪器需经过验证，确保性能稳定；三是试验数据需规范记录、妥善保存，便于后续追溯和审核；四是若药物存在代谢产物，可考虑同时检测代谢产物的细胞因子释放作用，全面评估药物的免疫原性风险。