《食品科学》：清华大学王垚博士等：提升酶型时间-温度指示器热稳定性的酶工程策略研究进展

伴随预制食品和生鲜产品的流行和冷链物流技术的进步，食品实现地理界限跨越，为消费者饮食生活带来多样化选择。但是，受热变质、冷链脱冷问题等引起的食品安全事件常有报道。时间-温度指示标签（TTI）因其优良的特性而被广泛应用于生鲜食品冷链温度和货架期监测。

基于指示原理，TTI被分为物理型、化学型及生物型，其中生物型又可分为酶型和微生物型。目前，常见的酶型TTI有脂肪酶型、淀粉酶型、糖化酶型、漆酶型等。国际上开展的多项应用于食品监测的TTI以酶型居多。由于酶的天然特性，酶型TTI不仅可用于监测食品的贮运过程和货架期，还可应用于食品生产制作过程，如泡菜发酵、冷冻牛肉高温解冻及方便杯面熟度指示等。不同酶型TTI的反应机理如表1所示。

在酶型TTI的研发和制备过程中，所监测产品的贮存条件和货架期决定酶的可选种类。但是，绝大多数酶与所监测产品在热稳定性上均存在偏差，需要进一步调整。酶工程基于近现代生物学、医学、食品科学中的技术和手段研究并改变酶的生物学性质，为提高酶热稳定性提供技术与手段。

清华大学工程物理系的彭华康、王垚*和北京大学人民医院妇产科的张焕芝等人针对当前酶工程提升酶热稳定性的研究进展进行综述，并概述相关策略，以期为酶型TTI的工业化应用提供参考。

1 酶固定化

固定化技术是酶工程的核心技术之一，该技术通过物理或化学手段将天然游离酶固定在特定载体上，一方面，可实现酶的回收利用，达到降本增效的目的；另一方面，能够使酶在限定的空间内实现高浓度聚集，同时维持其较高的催化活性和热稳定性，被广泛应用于工业生产中，不断推动生物催化和生物转化的发展。在酶型TTI中应用固定化酶，一方面可以提高酶的热稳定性，另一方面可以实现反应体系的固态化，从而解决体系易泄漏造成污染、制备流程难以产线化的弊端。

固定化酶的制备方法包括吸附法、包埋法、共价法及交联法，其中，包埋法在酶型TTI中的应用最为广泛。包埋法一般无需对酶进行修饰或改性（保留酶的原有结构），仅通过物理手段将酶嵌入高分子载体即可提高酶的富集度、活性和稳定性。包埋法分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法，所用材料均为生物大分子，如聚乙烯醇（PVA）、海藻酸钠、壳聚糖等。崔子杰等采用单因素试验和正交试验相结合的方法探讨微胶囊法制备固态脂肪酶型TTI的最佳配比策略，优化后的脂肪酶微胶囊制备工艺显著提高脂肪酶的热稳定性和耐碱性，有效拓宽脂肪酶型TTI的应用范围。Xu Fengjuan等以酪氨酸酶为原料，通过PVA凝胶包埋法制备固态酶型TTI，由于酶的稳定性和催化活性提升，该TTI的监测时长可达50.48 h。酶热稳定性的提高不仅可以延长酶型TTI的监测时长，还可以提高监测准确性。如采用海藻酸钠包埋法制备的固态糖化酶型和淀粉酶型TTI能够在变温条件下准确监测酸奶和冷鲜猪肉品质变化。

固定化技术可显著改善液态酶型TTI易泄漏和不稳定的问题，但固态酶型TTI目前尚未达到可工业化应用的地步。由于包埋材料的网状结构，酶促反应底物和产物会出现难以扩散的问题，影响酶促效率。此外，酶和底物难以自由扩散，同时，尽管固定化技术一定程度上提升了酶的稳定性，但是载体材料形成的微环境对酶的动力学性质仍有影响。为解决这些难题，一方面可从优化现有酶反应体系和包埋方案、制备复合固定化酶型TTI、提升TTI的稳定性方面入手；另一方面可从优化与开发固定化材料如纳米材料、高比表面积材料和电纺材料等方面切入，例如，相比于壳聚糖，电纺壳聚糖作为固定化载体可以进一步延长漆酶型TTI的监测时效，且整体指示反应更均匀，适用于更多种类的食品监测。

2 酶改造

相较于固定化，酶改造往往会带来更大的收益，但是酶改造技术在酶型TTI上的应用还比较少见。酶改造分为定向进化和理性设计。

2.1 酶的定向进化

定向进化是一种在实验室条件下模拟自然进化过程的技术。研究人员通过在体外环境中引入随机突变和基因重组创造出大量蛋白质变体；然后，根据需求和目标人为施加定向选择压力以筛选出具有所需特性的蛋白质（如酶），从而在分子层面上实现进化的模拟。在酶型TTI中常用的酶为脂肪酶和糖化酶，定向进化是提升其稳定性的主要途径。

定向进化是在蛋白质结构和作用机制未知的情况下引入大量突变以随机获取目标特性，因此，定向进化的成功率高度依赖突变库的多样性和筛选的高通量。一个成功的突变库不仅可以提高定向进化成功率，同时还能简化定向进化进程。建立基因突变库的工具和技术主要包括DNA重组、易错聚合酶链式反应（epPCR）、正交DNA复制系统（OrthoRep）、成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其关联蛋白（Cas）（CRISPR/Cas）系统和连续定向进化（CDE）等。

DNA重组是一种可有效对单基因或同源基因进行随机突变的体外重组技术。嗜热脂肪芽孢杆菌

-淀粉酶和杜邦嗜热菌（

Thermomyces dupontii

）脂肪酶经过DNA重组后的热稳定性分别提升5 倍和2 倍。相较于固定化，DNA重组可以在不损失酶活性的情况下显著提升其热稳定性。

DNA聚合酶在特定条件下会出现高频率错配，可利用这个特征在目的基因中引入随机突变。基于此原理，epPCR在1989年由Leung等提出。王亚伟等利用该方法分别将

-高甘露聚糖酶ManB的最适反应温度和熔解温度（

T

m ）提高5 ℃和1.3 ℃。相较于epPCR，Chen Keqin等开发的多重epPCR和Shao Weilan等开发的原位epPCR可以实现更便捷的转化和筛选，显著减少后续筛选工作量，同时允许多轮突变累积，在获得多个改进特性的突变体方面非常有优势。

单一突变的筛选与检测往往无法得到符合理想特性的酶。定点突变（SSM）是定向进化最常用的策略，该策略通过将饱和突变技术、epPCR、DNA重组等技术组合使用，快速实现有义突变累积，提高脂肪酶对映体选择性。但是，SSM的突变效率低、基因突变库缺乏多样性，往往需要经过多轮突变和筛选才能获得理想特性。随后，寡核苷酸饱和突变和多位点饱和突变等饱和突变技术的提出实现了基因突变库的多样性，保证了突变库的合理与完整。

OrthoRep是一种由Liu Chang团队开发的体内随机突变技术，突变率比染色体基因组突变高10万 倍。OrthoRep主要基于由1 个位于酿酒酵母细胞质中的含有目标基因的末端蛋白质粒和1 个靶向末端蛋白的DNA聚合酶组成的正交靶向系统实现目标基因的快速连续突变，且不影响染色体基因组的正常扩增。值得注意的是，OrthoRep编码基因的表达强度会受其组成元件的调控；启动子优化、poly(A)尾修饰及p2质粒等多种方案可进一步提升OrthoRep的实用性和表达强度。例如，García-García等通过OrthoRep提升THI4噻唑合酶在植物细胞中的催化效率和稳定性，以更好适应植物的生长发育。

细胞存在2 种DNA修复机制，即同源引导修复和非同源末端连接（NHEJ），其中NHEJ是体内产生突变的主要来源。研究者们利用CRISPR/Cas9技术在特定的DNA序列处引发一个具有定位性的双链断裂，并基于NHEJ开发了EvlovR、CRISPR-X和CasPER等CDE系统。EvlovR由Halperin等开发，并经过Hu等的优化实现了前间隔序列邻近基序的范围拓展。CRISPR-X由Hess等开发，可以通过一次转化突变多个基因组位点，将绿色荧光蛋白定向进化为增强绿色荧光蛋白。CasPER系统整合了CRISPR/Cas9和epPCR，可以将大型供体突变体文库整合至多个基因组位点，实现高效率和高通量的进化研究，成功率高达99%。

高质量突变体库可以在一定程度上提高筛选效率。但是，随着拟突变位点数目的增加，需要筛选的范围和复杂度也急剧增加。每个位点上的氨基酸突变均有20 种可能，每突变

X

个位点，则需要筛选的突变体库为20

X

，筛选工作量巨大且复杂。高通量筛选技术不仅可以节约时间和成本，还能够显著提高获得所需特性突变体的机率。平板筛选法、微孔板法、流式细胞荧光分选技术、液滴微流控技术等均是目前常用的筛选技术，分选数量级为10 4 ～10 9 。流式细胞荧光分选技术和液滴微流控技术主要通过酶活进行筛选，因此，更加适合进行酶的高通量筛选。岩藻糖苷酶、辣根过氧化物酶、羧酸酯酶、糖苷酶等均可通过这2 种方案进行筛选。

广泛应用于多肽和抗体筛选的噬菌体展示技术也可用于酶突变库的高通量筛选。碱性磷酸酶在噬菌体表面的有效催化证明了该技术在酶突变库高通量筛选中的应用潜力。噬菌体展示技术、噬菌体辅助连续进化系统、细菌表面展示技术和酵母表面展示技术等均是极为成功的高通量筛选技术，其筛选量级为107～109。

2.2 酶的理性设计

定向进化为人工提高酶的热稳定性提供了一种不可替代的方法，也使人们意识到蛋白质一级结构的重要性。但是，突变库建立和高通量筛选仍然具有许多问题。结构生物学的发展及X射线晶体学、核磁共振和冷冻电子显微镜等分辨率技术的进步为蛋白质结构解析提供可能，由此拉开了理性设计的大门。

2.2.1 基于结构热稳定性相关的理性设计

随着蛋白质组学的发展，越来越多蛋白质的结构和功能被解析，基于蛋白质的三维结构进行设计，通过对特定功能位点进行改造的（半）理性设计应运而生。相较于定向进化，酶的（半）理性设计主要目的是有目的性、精准地通过定点突变和片段插入/删除等操作获得期望或具有新颖特性的酶突变体，可大量精简突变体库规模及筛选操作量。（半）理性设计需要对蛋白质的三维结构和功能位点有深入的了解。与半理性设计最大的区别在于，理性设计更强调酶的突变方向，即已知突变与功能的联系。

蛋白质的三维结构、功能位点均与蛋白质的稳定性和生物活性高度相关。早在1986年，Bryan等通过分析发现热稳定枯草杆菌蛋白酶拥有更好的氢键参数，即在三维结构内拥有更短的位点距离和更直接的位点连接。除氢键以外，盐桥、芳环相互作用、疏水相互作用等非共价相互作用均在维持酶的构象和稳定性方面起着非常关键的作用。非共价相互作用可以给酶带来更高的刚性（氢键和盐桥）、更高的堆积效率（芳环相互作用）及更高的

-螺旋稳定性（疏水相互作用），从而使酶具有更稳定的构象和更好的热稳定性。折叠和未折叠状态之间的自由能差（Δ

G

）是决定酶热稳定性的另一重要因素。共价相互作用（二硫键）、特殊构象氨基酸（甘氨酸、脯氨酸等）及亚基相互作用均可改变Δ

G

。然而，酶表面区域的结构和功能对酶的热稳定性也非常重要。Arnold和Dong Chen等在酶的工程化改造过程中发现，许多酶活性口袋之外位点的改造也能够提升酶的热稳定性。糖蛋白表面的糖链序列（糖基化）、末端环化序列等表面结构往往也决定着蛋白质的热稳定性。不影响蛋白质折叠和构象的糖基化可以增强酶的热稳定性，而天然糖基化位点的消除一般会导致酶不稳定。糖基化工程是目前应用于改善酶热稳定性的新方法。

Reetz等提出的组合活性中心饱和突变策略（CAST）和迭代饱和突变技术极大精简了突变体库规模，提高了筛选效率。CAST方案广泛应用于改进酶的立体选择性、区域选择性、底物范围和催化效率等关键参数，这标志着酶工程从非理性设计向半理性设计的重要转变。此后，序列饱和突变技术、蛋白进化路径重建分析、集中理性迭代定点诱变策略、多重序列三维比对策略、蛋白质序列-活性相关性进化策略、基于体内同源序列的诱变重组技术及三密码子饱和突变策略等技术的提出标志着酶的理性设计逐渐成熟。研究者们可以通过这些技术构建“小而精”的突变体库，用于酶热稳定性的定向改造，大大降低筛选工作量。

2.2.2 基于计算机辅助设计的理性设计

传统的理性设计常采用多序列比对与蛋白结构分析相结合，找到与热稳定性相关的潜在位点，再通过湿实验进行验证。Chopra等通过该方法获取了热稳定性更高的脂肪酶。与传统理性设计（

T

m 提高小于15 ℃）相比，通过计算机辅助设计的理性设计可以获得热稳定性更高的突变体（

T

m 提高超过35 ℃以上）。

随着计算生物学和结构生物学的进步，借助于高性能计算机的大数据计算能力对蛋白质结构的全面模拟和预测变得更加精确，这为指导酶热稳定性改造提供了坚实的基础。基于计算机辅助技术，采用分子对接、分子动力学模拟、量子力学计算、蒙特卡罗方程法和模拟退火等多种计算方法，可通过虚拟实验预测并评估突变体在结构、自由能、底物结合能等方面的变化。通过这一循环迭代过程，研究人员能够筛选出具有期望特性的酶，并通过实验验证这些预测结果。与传统理性设计相比，计算机辅助设计可运用计算机解决绝大多数工作，大大节省时间和经费；此外，大量的数据库可为后续相同特性的酶设计提供计算模板。目前，在蛋白质的从头设计、酶的催化效率和热稳定性提高等领域已经取得一系列显著成就，其中一些成果已达到可应用于工业生产的水平。

计算软件和计算策略的进步有效提高了酶的改造效率。2003年，华盛顿大学的Leaver-Fay等开发的Rosetta软件如今已发展为集蛋白质从头设计、酶活性中心设计、配体对接、生物大分子结构预测等功能为一体的生物大分子计算建模与分析软件组合。此后的计算策略大多基于Rosetta软件设计策略。在热稳定性改造方面，由荷兰格罗宁根大学的Wijma等提出的FRESCO策略应用最为广泛。FRESCO策略采用Rosetta等多种计算软件预测能提高蛋白质热稳定性的单点突变，并利用分子动力学模拟筛选突变方案的可行性，再通过湿实验筛选出热稳定性提高的突变体，最后将一部分单点突变叠加，获得热稳定性大幅提高的多点突变体。该团队利用FRESCO策略分别将柠檬烯环氧化物水解酶和卤代烷脱卤酶LinB的

T

m 提高35 ℃和23 ℃。2016年，中国科学院微生物研究所的研究团队与荷兰格罗宁根大学及Enzypep公司携手，运用一种结合FRESCO与一致性分析的计算策略对多肽酰胺酶进行深入的工程化改造，成功开发出一种包含12 个关键突变位点的多肽酰胺酶突变体，并命名为PMA12A；PAM12A展现出卓越的热稳定性，其

T

m 高达76 ℃，并且能够在乙腈、丙酮等无水溶剂中维持数天的稳定活性。此外，由Diaz等开发的基于计算统计的辅助设计策略可以使马兜铃烯合成酶的

T

m提高45 ℃。Goldenzweig等通过联合计算策略，将乙酰胆碱酯酶突变体的热稳定性相较于野生型提高20 ℃。

近年来，人工智能（AI）辅助的酶分子改造技术在理性设计和定向进化上取得巨大成功；AI技术通过数据驱动的方式构建序列/结构-酶性能的预测模型，挑选优良突变酶，提高酶分子改造效率。AI利用机器学习模型、深度学习模型和数据库开发学习蛋白质序列、共进化信息和结构信息，实现大规模的酶活性表征和预测，从而预测有益突变，优化酶的热稳定性，提高催化活性。在AI辅助的酶工程研究中，研究者们仅需根据机器提供的突变体信息进行湿实验验证即可得到期望的酶突变体。传统机器学习的常见算法包括线性模型、随机森林、支持向量机、高斯过程等，其中，随机森林和高斯过程算法提供多种酶热稳定性改造实例，由P450 Diffusion方法生成的P450酶具有更好的酶活性和热稳定性，催化能力提升1.3～3.5 倍。与传统机器学习不同，深度学习算法的逻辑更类似人类大脑，会进行由低到高的特征学习及分层处理，不依赖于人工数据喂养，可以学习并展现更多基础数据的隐藏信息，深刻变革了机器学习领域。目前已有利用卷积神经网络和循环神经网络进行蛋白质结构预测的相关报道。由Deepmind公司开发的AlphaFold是深度学习在结构预测领域十分成功的案例，其参与蛋白质结构预测评估全球竞赛的43 个蛋白结构预测中，有25 个获得最高分。AlphaFold的出现为很多不具备结构解析条件的实验室提供了另一种理性设计方案，加速了酶进化的步伐。结构预测旨在了解现有的酶，深度学习算法还为从头设计自然界不存在的新酶提供了可能。AI深度学习算法可以从模型和数据库中获取结构信息以外的未知信息，提供与现有从头设计思路完全不同的酶设计方法，中国科学院微生物研究所的吴边团队使用深度学习算法构建了一系列新型酶蛋白，实现了自然界未曾发现的催化反应，并通过完全的计算指导获得工业级微生物工程菌株，推动

-氨基酸的高效、绿色合成。由聚树生物与清华大学深圳国际研究生院合作开发的DLKcat模型和GotEnzymes数据库能够实现大规模的酶活性表征，只需输入底物信息和酶的蛋白质序列，便能得到远多于数据库中收集的、具体的酶动力学参数，为深度学习模型提供精确和标准化数据，实现酶设计领域的数据-模型飞轮效应。此外，该团队开发的autoHIPPS系统可实现自动化、高通量“新酶序列”筛选，为AI酶参数预测提供大量高质量数据，显著提升AI模型的预测准确性和效率。

尽管计算机辅助设计在酶工程领域展现出巨大潜力，但是其进一步应用仍需克服预测准确性、数据质量、实验验证、蛋白质序列空间巨大、活性位点设计难度、稳定性和表达水平、多目标优化及深度学习模型局限性等多方面的挑战。

3 不同酶改造策略的优势和局限性

热稳定性是影响酶型TTI应用和推广的最主要因素，其不仅影响酶型TTI的监测准确性，还影响酶型TTI的形态、贮运及适用范围。传统的酶工程往往通过物理或化学交联提高酶的热稳定性，酶型TTI中的常用方式也基于此。但这些方案存在较大局限性，如安全性、酶活性、产品形态等（表2）。

固定化技术不仅能提升酶的回收率，还能显著提高酶的热稳定性。现有的固定化载体材料虽然能够增加酶的热稳定性，但往往会导致酶活性位点（活性口袋）的限位，从而降低酶活性。此外，不同的固定化方案对酶热稳定性的提升效率不一致，这会增加酶型TTI热力学拟合的工作量。近年来出现的一些新型载体材料不仅可以提供更完备的包埋方案，还能够保证酶与底物的充分接触，不会降低酶的活性。随着生物学、化学、物理学及材料学的进一步交叉，相信会有越来越多的新型载体材料被应用于酶的固定化中。综合当下材料的缺陷，酶型TTI中应用新型固定化材料应进行更理性的设计。例如，充分考虑酶的结构变化，保证酶与底物充分接触；在材料内部适当引入活性基团，保证酶反应环境的稳定性；充分考虑工业成本，使用更简便的方案和易获取的材料进行聚合和固定化。此外，酶型TTI产品形态也显著影响其应用范围，纸基化的开发是今后酶型TTI发展的主要趋势，新型固定化材料的研发将会显著推进酶型TTI纸基化的发展路径。

酶的定向进化和结构修饰是另外一种提升酶热稳定性的方案。定向进化技术在不依赖于蛋白质晶体结构和催化机制等详细信息的情况下，虽然能够实现蛋白质功能的优化，但常常面临筛选效率瓶颈；半理性设计方法则在一定程度上平衡了序列空间多样性和筛选工作量，通过结合一些已知的生物学信息指导蛋白质改造；相比之下，理性设计则基于深入的分子机制理解创造出自然界中不存在的新型酶和催化反应，从而拓展生物催化的应用范围。酶型TTI作为一种工业化方案，在实际应用中更需要考虑技术的成熟性和成本。在开展具体的酶修饰案例时，应充分考虑各项技术优势，结合实际需求和应用成本进行改造。单一的特性改造和筛选并不会显著增加定向进化的工作量和复杂程度，因此，定向进化目前仍然是酶型TTI产业中最主要的热稳定性改造方案。随着（半）理性设计的进一步成熟，酶的改造和设计将更加简便、成本更低。

随着生物信息学和计算生物学的发展，酶的理性设计和从头设计越来越简便。干-湿实验结合将是未来酶工程工作者的主要工作模式。计算机辅助设计和机器学习将会替代并优化众多反复的筛选工作。同时，由于数据库的建立和扩大，机器学习将可能提供完全不同于现今工作路径的新酶发现方案。

结 语

酶型TTI能通过颜色变化直观反映食品的全程温度变化并指示保质期，但由于酶固有的热稳定性问题，其应用与工业推广受贮藏条件、监测精度等限制。酶工程策略的单一或综合应用可以克服酶型TTI热稳定性的关键技术瓶颈。但是，酶工程策略均存在自身局限性，未来需整合跨学科技术以优化现有方法，实现精准、高效的酶性能改造，促进酶型TTI的推广和应用。酶型TTI的发展瓶颈不仅在于热稳定性，更在于其单一的监测指标。伴随着食品行业的发展和生活水平的提高，消费者将会更关注食品的新鲜度、口感等多种维度，因此，需要对酶进行更多特性的改造或从头设计，以使其符合消费者的需求。机器学习将有极大可能设计出能够催化多种专一反应的酶以监测多个指标，这将进一步拓宽酶型TTI应用范围，促进酶型TTI的推广和应用。

引文格式：

彭华康, 张焕芝, 王晨跃, 等. 提升酶型时间-温度指示器热稳定性的酶工程策略研究进展[J]. 食品科学, 2025, 46(10): 378-386. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240703-041.

PENG Huakang, ZHANG Huanzhi, WANG Chenyue, et al. Research progress in enzyme engineering strategies to improve the thermal stability of enzymatic time-temperature indicators[J]. Food Science, 2025, 46(10): 378-386. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240703-041.

实习编辑：普怡然 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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