J Med Virol丨警惕FRET筛选方法陷阱，筑牢抗病毒药物发现的第一道防线

新冠病毒主蛋白酶在调控病毒复制与免疫逃逸过程中发挥了重要作用，使其成为抗病毒药物开发的理想靶标 之一 。 在抗病毒药物 研究 中， 研究者 主要 使用 荧光共振能量转移 （ FRET ） 筛选 方 法 进行 主 蛋白酶抑制剂的 高通量筛选。 然而，在对 已报道的 主 蛋白酶抑制剂进行再评价研究 时， 发现 先前 诸多 研究 存在 假阳性结果。重新审视和反思 FRET 筛选 方 法的实验设计迫在眉睫。

近日，皖南医学院陈云雨博士团队在 Journal of Medical Virology 发表了题为

Fluorescence Resonance Energy Transfer Assay at the Crossroad: Urgent Reexamination of Assay Design for Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Main Protease Inhibitors

1. 被忽视的三大“陷阱”

陷阱一 : 酶的“活性之谜” 。主蛋白酶 是半胱氨酸蛋白酶，其 活性严格依赖于同源二聚体结构。然而，许多研究中表达的 主蛋白酶 通常 在 其 氨基 端融合 有 多聚组氨酸等标签 ，这将 严重破坏 蛋白 酶 的催化 活性。 高活性蛋白酶的制备是蛋白酶抑制剂 高效 筛选的重要基础。

陷阱二 : 环境的“隐形干扰” 。 白桦酸等天然产物 能 产生 典型的 胶体聚集 效应 ， 可 以 非特异性 抑制 蛋白酶 活性 ，产生假抑制信号。 槲皮素等 天然产物 具有 荧光淬灭特性，会直接干扰 荧光 信号读数的真实性，导致 假阳性结果 。 遗憾的是， 在先前 的诸多 研究中， 这些干扰因素在 FRET 筛选 方 法中并 未得到 研究者的 充分 重视 。 因此，在酶促反应 条件 优化的基础上，在反应缓冲液中适量加入 EDTA 、 DTT 和 去污 剂 等 组分 是 非常必要 的 。

陷阱三 : 分析的“逻辑陷阱” 。 在 FRET 筛选 方 法 中， 许多 研究者 利用非线性酶促 反应终点 和起点 间 的 相对 荧光值 之 差计算酶抑制率 ， 导致 假阳性结果 。 研究者 基于酶 促 反应的初 速度 进行 酶抑制活性 分析 是至关重要的 。 此外， 苗头化合物还需 利用多种生化方法 严格地 进行 酶抑制活性 评价 研究 。

2. FRET筛选方法的全新替代方案:荧光底物水解法

面对传统 FRET 筛选 方 法 的固有 缺陷 ， 研究 团队 设计 了一项创新性 替代 方案 用于抗病毒药物 的 筛选与评价。 主 蛋白酶 荧光底物 的 设计 原理简单 且 巧妙： 首先， 将 淬灭态的 RFP-A 1 与无荧光的 RFP-B 1 通过连接肽（ AVLQS ）连接 形成异源二聚体。 在完整状态下， 二聚体 将 产生 高 强 度 红色荧光；当 主 蛋白酶 切割连接肽后，二聚体解离，导致荧光 值 急剧 降低 。 研究者 利用 荧光动力学法 和 电泳法的组合式实验即可快速 筛选蛋白酶抑制剂（图1）。 荧光底物水解法 具有 经济 简便和灵敏可靠等优点， 是 FRET 筛选 方 法的理想替代方案 。此外，该模块化荧光底物 设计策略 也 具有良好的普适性 ，仅通过替 换“ 切割序列”，即可快速改造为通用型抗病毒药物 高通量 筛选 平台。 目前，荧光底物水解法已 被 应用于肠道病毒 3C 蛋白酶和基孔肯雅病毒 nsP2 蛋白酶抑制剂 的高通量筛选 ， 初步 发现了 5 个 具有优异 抗病毒 活性的新型先导化合物。

图 1. 新冠病毒主 蛋白酶荧光底物的 设计原理

在新发 突发 传染病威胁不断的时代 ，抗病毒药物研究任重道远。本 文 不仅为新冠病毒 主蛋白酶 抑制剂的 高通量 筛选敲响了警钟，也为未来抗病毒药物 发现 提供了 全新的 技术 方案 。 本文 认为， 科学探索需要不断反思与改进， 文中 提出的 荧光底物水解法 仅 是抛砖引玉，期待能激发更多关于 抗病毒药物筛选 技术 创新的讨论与合作。

皖南医学院药学专业硕士研究生叶健凯为论文的第一作者，陈云雨 博士 为论文的通讯作者。

原文链接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.70801

制版人：十一

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