Nature 丨邹贻龙团队与合作者开发新型微米级深度空间蛋白质组学技术—— iPEX

2025年11月12日，西湖大学邹贻龙团队及Kiryl D. Piatkevich团队在Nature发表题为iPEX enables micrometre-resolution deep spatial proteomics via tissue expansion的研究长文，成功开发了将基于水凝胶的蛋白质锚定、组织膨胀与基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）深度融合的新技术iPEX（in situ imaging Proteomics via Expansion）。该技术突破了传统空间蛋白质组学在分辨率和检测灵敏度上的瓶颈，实现了在多种组织中以1-5微米有效像素尺寸、无偏、高通量地检测数百至逾千种蛋白质，为在单细胞及亚细胞水平解析蛋白质的空间分布和功能提供了强大工具。应用iPEX于阿尔茨海默病小鼠模型，研究者揭示了疾病早期发生的线粒体功能紊乱以及脂代谢关键酶ACAA1的下调如何驱动长链多不饱和脂肪酸生物合成障碍，为神经退行性疾病的早期分子事件提供了新颖见解。

一、空间蛋白质组学的“分辨率困境”

在生命科学的“后基因组时代”，蛋白质作为生命活动的主要执行者，其表达水平、修饰状态和空间定位共同决定了细胞的命运与功能。近年来，空间转录组学技术蓬勃发展，让我们能够以极高的分辨率窥见RNA在组织中的分布。然而，在蛋白质层面，实现同等分辨率的无偏分析却面临巨大挑战。

现有的空间蛋白质组学技术主要分为两类：

1. 基于抗体的成像技术（如CODEX、IMC）：需要预先知道目标蛋白，并制备特异性抗体，无法发现新靶点，且通量受限于抗体数量。

2. 基于质谱的技术：

• 激光捕获显微切割（LCM）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）：以Deep Visual Proteomics为代表，虽然能够实现无偏检测，但需要通过LCM分离目标区域，过程繁琐、通量低，且空间分辨率受限于切割精度（通常在100微米级别）。

• 基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）：无需标记，可直接在原位检测并绘制多种分子的空间分布图，具有高通量潜力。然而，受限于仪器激光光斑大小和电离效率，其空间分辨率通常难以低于10微米，且对于丰度较低的蛋白质，鉴定数目非常有限。

简而言之，“高分辨率”与“高覆盖度、无偏性”在空间蛋白质组学领域似乎难以兼得。研究者们迫切需要一种能够打破现有物理与技术极限的新方法。

二、 iPEX技术的诞生：当蛋白锚定与组织膨胀遇上质谱成像

受到组织透明化(Tissue clearing)与膨胀显微镜（Expansion Microscopy, ExM）的启发，西湖大学的研究团队开始思考：能否通过将组织中的蛋白质优先锚定到高分子网络上，来去除其他所有生物分子对质谱检测包括质谱成像检测的干扰，增加蛋白质的检测效率？同时，是否可以通过将蛋白锚定后的样本进行各向同性的物理膨胀，来突破质谱仪器检测的空间分辨率限制？

在技术设计中，膨胀显微镜的核心是通过将组织样本的特异性基团共价嵌入可膨胀的水凝胶中，使其在浸泡于水中时实现各向同性的物理放大，从而使得原本密集的生物结构被“拉开”，利用普通显微镜即可实现超分辨率成像。研究团队设想，如果组织被膨胀，那么原本低于质谱仪分辨率的细微结构将被放大，从而使得在膨胀后的组织上进行MALDI-MSI扫描时，其有效像素尺寸（Effective Pixel Size, EPS）得以等比例缩小。例如，以30微米的扫描像素尺寸（SPS）扫描一个线性膨胀了6.2倍的组织，其有效分辨率可达4.8微米。

然而，将这一设想变为现实面临多个环节的技术挑战：蛋白质如何在水凝胶中被有效锚定并实现各向均匀膨胀？膨胀过程会否导致蛋白质/肽段的丢失或扩散？经过膨胀和处理的样本是否仍能被有效酶解？释放的肽段能否与MALDI基质共结晶并有效电离？如何识别质谱成像获得的信号峰并匹配到多肽-蛋白质？

经过系统的优化，团队最终成功建立了完整的iPEX技术流程（图1）：

1. 固定与锚定：组织切片后，使用N-琥珀酰亚胺丙烯酸酯（NSA）将蛋白质共价锚定到水凝胶网络上。

2. 凝胶化与均质化：进行单体聚合形成水凝胶，随后使用SDS等试剂进行组织均质化和蛋白质变性，使用DTT-IAM实现蛋白质还原、烷基化。

3. 膨胀：在缓冲液中使水凝胶发生各向同性膨胀，线性膨胀因子（LEF）通常控制在3-7倍，最高可达20倍。

4. 原位酶解与MALDI样品制备：将膨胀后的水凝胶转移到导电载玻片上，进行喷雾法蛋白酶（胰蛋白酶等）消化，将蛋白质原位酶切为肽段，最后沉积MALDI基质（CHCA）。

5. MALDI-MSI数据采集与分析：在质谱仪上采集空间质谱数据，并通过自主研发的计算流程进行峰识别、去同位素、与邻近组织样本构建的LC-MS/MS谱图库进行比对，最终实现蛋白质的初步鉴定与空间定位。

图1.

研究团队通过一系列严格对照的实验验证了iPEX的可行性。他们发现，标准肽段在膨胀后的水凝胶中依然可以被稳定检测且无明显的m/z偏移。在模型蛋白BSA和小鼠视网膜组织中，iPEX展现出了远超传统MALDI的检测灵敏度：在4.8微米EPS下，iPEX鉴定到1862个蛋白酶依赖性离子特征（推定为肽段），并注释出334个含有≥2个独特肽段的高置信度蛋白质；而传统MALDI在5微米SPS下仅鉴定到166个离子和20个蛋白质。iPEX在将空间分辨率提升了一个数量级的同时，将蛋白质的检测灵敏度提升了1-2个数量级。

三、 iPEX的强大性能：从视网膜分层到全组织应用

为了全面展示iPEX的能力，研究团队在多种组织和模型系统中进行了测试。

1. 高分辨率解析小鼠视网膜精细结构

小鼠视网膜具有清晰的分层结构，是验证空间分辨率的理想模型。iPEX处理后的视网膜不仅完好地保留了其细胞构筑，还能清晰地分辨出光感受器层（PL）、外核层（ONL）、外丛状层（OPL）、内核层（INL）、内丛状层（IPL）和视网膜节细胞层（RGL）。通过无监督聚类分析，仅基于蛋白质表达谱，iPEX就能自动将不同细胞层完美地区分开来。研究人员进一步鉴定出各层富集的标志性蛋白质，如光感受器层富集S-抗原视觉抑制蛋白（SAG），ONL和INL（细胞核所在层）富集组蛋白H1-4。这些结果均通过MS/MS碎片谱图和免疫荧光染色得到了验证。尤为值得一提的是，iPEX甚至能够清晰地可视化OPL这一仅厚15-25微米的突触层中表达的蛋白质，如网格蛋白重链（CLTC），而传统MALDI几乎无法检测到该层的信号。

2. 广泛的组织适用性与高重复性

iPEX的应用并不仅限于视网膜。研究团队在小脑、大脑、肠道、肝脏以及人胚胎干细胞来源的脑类器官中均取得了成功应用。

小脑：在3.9微米EPS下鉴定到640个高置信度蛋白质，像素聚类清晰区分出颗粒层、分子层和小脑核。

大脑：在15.2微米EPS下鉴定到857个蛋白质，聚类结果与Allen小鼠脑图谱的解剖结构高度吻合，并能对海马区进行亚结构解析。

肠道与肝脏：分别在2.4微米和4.3微米EPS下鉴定到超过1000个蛋白质，成功绘制出肠道隐窝-绒毛-肌肉层以及肝脏中央静脉-肝实质的蛋白质空间分布图。

脑类器官：在10微米EPS下鉴定到1241个蛋白质，揭示了类器官中神经前体细胞与分化神经元区域的空间异质性。

此外，通过荧光标记示踪和重复样本分析，研究证实iPEX流程中肽段的扩散极小（<2微米），且技术重复性高，不同样本间肽段检测的一致性和强度相关性均非常出色。

四、 揭秘阿尔茨海默病空间蛋白质组景观

在证明了iPEX的技术实力后，研究者将其应用于5xFAD阿尔茨海默病模型小鼠，旨在揭示疾病发展过程中不同脑区的蛋白质组动态变化。

在11月龄的5xFAD小鼠脑中，iPEX在16.7微米EPS下，在WT和5xFAD组分别鉴定到971和968个高置信度蛋白质。差异表达分析揭示了疾病相关的蛋白变化，例如在纤维束（FT）中髓鞘碱性蛋白（MBP）的下调，这与AD中脱髓鞘的报道一致；在海马体中，谷胱甘肽S-转移酶Mu1（GSTM1）的下调也与已知的疾病风险因素相吻合。

更引人注目的是，STRING蛋白互作网络分析发现，在5xFAD小鼠的纤维束和海马体中，有一系列线粒体代谢相关蛋白同步下调，包括线粒体融合蛋白2（MFN2）、短链烯酰-CoA水合酶1（ECHS1）等，而动力相关蛋白1（DNM1L）则上调，提示线粒体动态和代谢功能在AD中发生紊乱。后续的免疫荧光、活体线粒体染料染色以及透射电镜分析均证实，在2月龄（疾病早期）的5xFAD小鼠脑中，就已出现线粒体的显著肿胀和融合。

这一发现促使研究者对2月龄的早期病变小鼠脑进行iPEX分析。结果发现，过氧化物酶体乙酰-CoA酰基转移酶1（ACAA1）在多个脑区，尤其是纤维束和海马体中，出现了显著的早期下调。一例家族性遗传学研究曾发现，ACAA1的硫解酶功能缺失突变体N392S是该汉族谱系早发性家族性AD的强风险因子。iPEX的空间定位能力，首次在动物模型中原位捕捉到了这一关键蛋白的早期变化。

五、 ACAA1缺失如何驱动神经退行？—— 脂代谢紊乱是关键

ACAA1是过氧化物酶体中脂肪酸β-氧化最后一步的关键酶，负责将超长链多不饱和脂肪酸（VLC-PUFA，如C24:6）转化为对神经功能至关重要的长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA，如DHA，C22:6）。

为了探究ACAA1下调的功能后果，研究团队在ACAA1敲除的人源胶质瘤细胞U251MG和诱导多能干细胞（iPSC）及其分化的谷氨酸能神经元、皮质神经元和微胶质细胞中进行了系统的脂质组学分析。结果发现：

• ACAA1缺失会导致LC-PUFA（如DHA, C22:6）水平显著下降，而其前体VLC-PUFA（如C24:6）则发生累积。

• 这种“ retroconversion ”（逆向转化）障碍进一步导致细胞膜上富含LC-PUFA的磷脂（如PE, PC）水平降低。

• 在ACAA1敲除细胞中回补野生型ACAA1可以恢复正常的脂质谱，但回补AD相关的N392S突变体或催化结构域截短的突变体则无法实现挽救。

• 这些结果清晰地表明，ACAA1通过其硫解酶活性，在维持大脑LC-PUFA（尤其是DHA）稳态中发挥着核心作用。而DHA是神经元膜磷脂的关键成分，对突触可塑性、信号转导和神经炎症调节至关重要。因此，在AD早期出现的ACAA1下调，可能通过破坏神经元膜的脂质组成和功能，进而促成神经退行性病变的发生。

六、 总结与展望

iPEX技术的成功开发，是空间组学领域一个重要进展。它不仅初步解决了长期困扰该领域的分辨率与灵敏度难以兼得的核心矛盾，更以其广泛的组织适用性和高鲁棒性，为生物医学研究开辟了新的道路。

其技术优势可能源于：

• 物理放大：直接突破激光扫描移动精度及光斑直径决定的仪器硬件分辨率极限。

• 分子去拥挤：组织膨胀稀释了与小分子代谢物等离子的竞争，提升了肽段的电离效率。

• 酶解效率提升：膨胀后更大的表面积提高了蛋白酶与底物的接触效率。

• 扩散限制：致密的水凝胶网络有效限制了肽段的扩散，保持了空间保真度。

展望未来，iPEX在以下方面具有巨大应用潜力：

• 发现生物学：无偏地发现新的细胞类型、状态或疾病特异性生物标志物。

• 精细结构研究：研究以往难以分离的结构，如轴突、突触、免疫突触等。

• 微环境分析：绘制肿瘤微环境、组织发育等过程中的蛋白质空间互作网络。

• 多组学整合：与空间转录组、代谢组等技术结合，提供更全面的分子视角。

当然，iPEX也面临一些挑战，例如目前对蛋白质的注释仍需依赖LC-MS/MS谱图库，且流程对FFPE样本的兼容性有待进一步优化。随着组织膨胀技术和质谱成像硬件软件的持续革新，特别是与MS/MS兼容模式的整合，iPEX技术将愈发强大。

西湖大学团队的这项工作，为生命科学与医学研究提供了具备实用性的非靶向空间蛋白质组学平台，使研究人员能够在微米尺度、无偏地观察成百上千种蛋白质在复杂组织中的定位。同时，通过对AD模型的深入研究，将ACAA1介导的LC-PUFA生物合成障碍推到了神经退行早期事件的舞台，为理解AD病理机制和开发早期干预策略提供了全新的科学线索。

该研究由西湖大学团队独立完成。西湖多维动态代谢组学核心实验室主任邹贻龙博士和西湖大学Kiry D.Piatkevich博士为本文的共同通讯作者；西湖大学生命科学学院博士生王凤翔、孙翠骥以及吴天舒为本文的共同第一作者。研究过程中，西湖大学刘晓东团队提供多能干细胞诱导的脑部细胞模型支持，西湖大学生物医学实验技术中心质谱与代谢组学平台提供质谱设备支持、高性能计算中心提供大数据分析支撑以及实验动物中心提供了多项技术支持。

https://www.nature.com/articles/s41586-025-09734-0

制版人： 十一

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