APPS | 高压灭菌处理调节芸豆的致敏性：体外胃消化后的蛋白质组学与生物信息学见解

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Abstract

红芸豆（Phaseolus vulgaris L.）作为一种营养丰富的豆类，其致敏性长期存在，这使其在食品应用中面临显著限制。本研究通过体外胃肠道消化模型，结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）、免疫印迹法及计算表位预测技术，评估了工业高压灭菌（121 °C，15 min）对红芸豆致敏性调控的双重作用。电泳图谱分析显示，主要过敏原（包括43 kDa菜豆素样蛋白、凝集素亚基（31/25 kDa））发生部分降解。其中，豆球蛋白α亚基表现出胃蛋白酶抗性（稳定性达74.8%），而α-淀粉酶抑制剂（α-AI）和3组晚期胚胎富集蛋白（G3LEA）则快速降解。色谱免疫反应筛选结果表明，经高压灭菌处理的样品产生了8种抗原组分，其中包括具有增强免疫球蛋白E（IgE）结合潜力的新型疏水性肽段。质谱分析显示，未处理（生豆）消化物和高压灭菌处理消化物中分别鉴定出849和1516种独特肽段，且处理后表位以菜豆素和凝集素为主。生物信息学分析突出显示，菜豆素和凝集素中存在保守的致敏基序（如VLVKPIQIR、LPQQADAE），同时还存在具有同源性的交叉反应序列。矛盾的是，高压灭菌虽降低了完整过敏原的含量，但通过表位的构象暴露及疏水性残基富集，反而增加了免疫反应多样性。这些研究结果强调，在豆类加工过程中，有必要进行表位特异性风险评估，以平衡热加工干预的益处与潜在的意外致敏风险。

Introduction

随着人们健康意识的不断提升以及对均衡营养饮食的日益重视，作为优质健康蛋白质来源的植物基蛋白质，其需求正迅速增长。在众多植物蛋白来源中，豆类因其丰富的营养成分而备受关注。红芸豆营养密度高，富含优质蛋白质、碳水化合物（包括膳食纤维）以及矿物质和维生素，这种营养特点使其在兼具主食与功能性配料双重角色方面能提供全面的营养支持，进而推动其被广泛应用于各类工业食品生产中，涵盖罐头制品、即食餐食及冷冻食品配方。值得注意的是，红芸豆具有出色的蛋白质生物利用率和成本效益，这使其成为新兴植物基人造肉及低敏婴儿营养食品中的核心配料，与全球向可持续蛋白质来源转型的趋势相契合。然而，致敏性问题是红芸豆食品生产中无法回避的重大挑战。红芸豆持续存在的致敏性，仍是其在食品体系中安全应用的关键障碍。流行病学研究表明，在地中海地区人群中，芸豆（此处特指红芸豆类）引发的过敏占儿童豆类过敏案例的80%；在土耳其豆类过敏儿童群体中，芸豆更是主要过敏原，发病率高达66%。已有研究通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术发现，凝集素、菜豆素、α-AI及3组晚期胚胎富集蛋白（G3LEA）是红芸豆的主要过敏原。

在西方工业化国家，热力加工和罐头加工技术已成为豆类制品的主要保鲜方式。这种方法不仅能显著延长保质期、提高物流效率，还符合当代消费者对便捷即食食品的偏好。在科学研究领域，工业高压灭菌工艺（通常为121 ℃处理15 min）尤为受关注，该工艺会使蛋白质的致敏性发生显著改变。以往研究表明，热变性可通过改变致敏表位的结构，大幅降低其免疫反应潜力。具体而言，与未处理的红芸豆相比，经121 ℃、15 min热处理后，红芸豆中的凝集素和胰蛋白酶抑制剂（二者均被认为是高致敏性成分）含量降低了40%～60%；并且，这些热不稳定蛋白会因湿热加工发生构象失活。

此外，当前的致敏性评估主要依赖纯化的蛋白质分离物，却严重忽视了抗原在胃肠道转运过程中的蛋白水解重构。这种简化的研究方法无法模拟调控蛋白质稳定性与免疫反应性的、具有区域特异性的生化环境。未被消化的蛋白质或其部分水解片段可能避开胃内降解过程，进而与肠道免疫监视机制相互作用，引发过敏反应。值得注意的是，尽管胃肠道蛋白酶会催化食物过敏原发生广泛的蛋白水解，但具有抗性的免疫反应性表位在消化后仍能保留下来，且依旧具备交联IgE受体、持续诱发Ⅰ型超敏反应的能力。这一发现表明，胃是调控口服耐受性的关键免疫检查点：在该部位，消化效率是影响下游肠道抗原提呈细胞活化及辅助性T细胞2型（Th2）极化的决定性因素。

因此，本研究系统比较了未处理红芸豆（RKB）和高压灭菌红芸豆（ARKB）在模拟胃消化后的体外致敏特征。研究采用SDS-PAGE、LC-MS/MS及免疫印迹法的多分析技术，对胃消化抗性肽的组成与稳定性进行表征。同时，利用授权线性B细胞表位预测工具（ILBE）和迭代B细胞表位构象集合学习工具（IBCE-EL）进行计算表位预测，以补充实验数据，从而实现对残留抗原决定簇的全面评估。这些方法共同揭示了高压灭菌加工调控致敏风险的作用机制，为豆类加工行业优化食品安全规程建立了基于实证的理论框架。

Results and Discussion

RKB和及ARKB蛋白质的胃肠道稳定性电泳图谱分析

在SDS-PAGE分析中，红芸豆蛋白质显示出多种多肽亚基，分子量范围为93～17 kDa。其中，主要亚基的分子量经鉴定分别为55、46～40、32和21 kDa。为减少SDS-PAGE成像中脱色伪影和背景干扰所导致的分析误差，研究采用Quantity One软件（v4.6.9）中的数学解卷积算法对蛋白条带进行定量分析。该方法可精准区分6种不同的蛋白质条带，其中43 kDa条带（经鉴定为菜豆素）的相对丰度最高。

图1 （A）RKB和（B）ARKB消化样品中的蛋白质分布（Quantity One 软件分析）

43 kDa菜豆素样蛋白

尽管经过120 min的模拟胃肠道消化，RKB样品中仍保留有19.8%的43 kDa蛋白（信号强度从180降至35.7强度单位）。ARKB样品中该蛋白的残留信号强度仍超过10%，这表明这种假定的菜豆素同源蛋白经热加工后获得了一定程度的热稳定性。

凝集素亚基（31/25 kDa）

分子量为31和25 kDa的蛋白质对胃蛋白酶水解表现出极强的抗性。120 min后，31 kDa条带的初始光密度（130 强度单位）降至62.1 强度单位，仍有52.3%的蛋白质保持完整。经鉴定，这些亚基是红芸豆凝集素的组成部分，在胃部环境中展现出固有的稳定性。对纯化凝集素的对比实验显示，60 min时红芸豆凝集素仍保留56.5%，而黑豆凝集素仅保留12.94%。这种稳定性使得完整的凝集素能够到达肠道上皮细胞，引发免疫介导的过敏反应。尽管高压灭菌（95 ℃）可通过破坏凝集素的二级结构、暴露疏水性残基及酶切位点，提高其对蛋白酶的敏感性，但本研究在消化后仍观察到残留的凝集素条带。这种差异可能源于全豆体系与纯化凝集素模型中的基质效应——在全豆体系中，热诱导的聚集作用可能会遮蔽蛋白酶的识别位点。

豆球蛋白亚基（35～55 kDa-α亚基/21 kDa-β亚基）

豆球蛋白由通过二硫键连接的α亚基（35～55 kDa）和β亚基（21 kDa）组成，其消化性存在差异。在胃消化过程中，α亚基呈现出逐步积累的趋势，在 120 min时达到峰值，这表明其具有胃蛋白酶抗性。相反，β亚基的信号强度从90.9 强度单位轻微降至68.0 强度单位，稳定性保持在74.8%。

α-AI与G3LEA的降解

α-AI是一种分子量为36 kDa的防御性蛋白，可抑制肠道淀粉酶活性；在模拟消化过程中，其对蛋白酶的抗性呈现剂量依赖性。对α-AI进行20 min高压灭菌或5～10 min煮沸处理，可使其几乎完全降解。与之不同的是，G3LEA（分子量50 kDa）的抗性极低：在RKB样品中，该蛋白在5 s内即发生降解；而热加工进一步加剧了其降解过程。

红芸豆消化肽的色谱图谱分析与免疫反应性表征

如图2所示，本研究采用反相高效液相色谱（reversed-phase HPLC）技术，对RKB和ARKB模拟胃肠道消化产生的肽段图谱进行了系统分析。结果显示，RKB与ARKB样品的色谱图谱存在明显差异：在10.4～24.30 min的保留时间窗口内，RKB消化物呈现出8个清晰的色谱峰，而ARKB样品在此区间内仅出现7个峰。值得注意的是，组分5在两种处理组中均为优势峰。此外，ARKB样品在后期洗脱阶段（24.37～70.00 min）表现出更强的异质性，具体特征为色谱峰形态不规则且基线噪音增加，这提示高压灭菌处理更易生成疏水性肽段。洗脱图谱的这种差异可能反映了热加工引发的蛋白质结构修饰：高压灭菌可能通过β-折叠结构变性和二硫键重排，破坏蛋白质的天然构象，从而使原本隐藏的酶切位点暴露于胃蛋白酶中。随后，这些结构修饰后的蛋白质底物发生蛋白水解，可能生成疏水性特征改变的肽段群体，这与观察到的后期色谱峰展宽现象一致。

图2 RKB和ARKB抗消化肽的高效液相色谱（HPLC）分析与斑点印迹分析

红芸豆消化物免疫反应性筛选结果

为全面开展免疫反应性筛选，研究根据峰分离标准，分别从RKB消化物和ARKB消化物中收集到14和13个色谱组分，分别记为RKB组分（F1-F14）和ARKB组分（C1～C13）。RKB组分表现出选择性免疫反应性：与阳性对照（F15）相比，组分F2、F4、F10和F11呈现阳性杂交信号（图2C）。定量光密度分析显示，F2和F4是主要的免疫优势组分。这种优先的抗体结合作用与早期洗脱组分（F2、F4）中亲水性表位的存在相关，提示水溶性可增强过敏原与抗体的相互作用。ARKB样品则表现出更广泛的免疫反应多样性：相较于对照（C14），共鉴定出8个阳性组分（C1、C2、C4、C5、C7、C11、C12、C13）（图2D）。晚期洗脱反应组分（C11、C12、C13）的出现表明，热加工可产生新的抗原基序。RKB与ARKB样品免疫反应性图谱的差异（分别为4个和8个反应组分）从定量角度证明，尽管高压灭菌降低了完整蛋白质的含量，却反而反常地提高了致敏潜力。

免疫反应性肽段的质谱表征

对斑点印迹阳性的样品组分进行质谱（MS）分析，结果如图S2所示。在RKB的斑点印迹阳性样品中，共检测到61个（F2组分）、185个（F4组分）、186个（F10组分）和467个（F11组分）消化肽段。整合所有质谱数据并去除重复肽段后，共鉴定出849个独特肽段。排除未知蛋白来源的条带后，肽段数量最多的来源是3组晚期胚胎富集蛋白（G3LEA），共28个肽段（占总数的3.3%）；其次是含蛋白激酶结构域的蛋白（23个肽段，占2.3%）、菜豆素类蛋白（15个肽段，占1.8%）；含Cupin 1型结构域的蛋白和脂氧合酶各贡献13个肽段。此外，豆球蛋白来源的肽段有10个，甘露糖凝集素FRIL（Flt3受体相互作用凝集素）来源的肽段有9个，菜豆红细胞凝集素（PHA-E）和菜豆白细胞凝集素（PHA-L）分别贡献2和5个多肽片段。同时，还鉴定出1个与α-AI相关的肽段（图3A、B）。

图3 RKB（共849 条肽段信息）和ARKB（共1516 条肽段信息）中抗消化阳性肽的分布

ARKB样品的质谱分析结果

在ARKB样品中，通过MS鉴定出2077条消化多肽序列（图S3、S4）。去除重复序列后，共获得1516个独特多肽片段，这些片段分布在不同组分中。其中，菜豆素来源的肽段含量最高（54个，占总数的3.6%）；PHA-E和PHA-L各贡献11个肽段；豆球蛋白贡献19个肽段（占1.3%）；含激酶结构域的蛋白贡献12个肽段（ 0.8%）；而G3LEA来源的肽段则减少至8个（占总数的0.5%）（图3C、D）。

引发阳性过敏反应组分中肽段条带的分布差异

在引发阳性过敏反应的组分中，RKB与ARKB的肽段条带分布存在差异。在RKB样品中，G3LEA来源的肽段含量最高（28个片段，占比3.3%），而在ARKB样品中该类肽段减少至8个（占比0.5%）。这种减少可能是因为RKB中的G3LEA对胃蛋白酶水解的抗性较低，经高压灭菌处理后更易发生降解。在ARKB样品中，菜豆素是主要的多肽来源（占比3.6%），高于RKB样品中的占比（1.9%），这可能是由于加热降低了菜豆素对胃蛋白酶消化的抗性。含激酶结构域的肽段占比从2.3%降至0.8%，而豆球蛋白片段占比相对稳定（1.17%～0.90%），这表明豆球蛋白对胃蛋白酶水解和高压灭菌处理均具有抗性。此外，加热使凝集素来源的肽段占比从0.08%提升至1.1%，且凝集素衍生肽段的数量从RKB样品中的7个增加至ARKB样品中的22个。因此，这种系统性分析可能表明，热加工是一把“双刃剑”：虽能降低菜豆素的致敏性（积极作用，+），但可能会增加凝集素相关的致敏风险（消极作用，–）。

质谱鉴定致敏肽来源的生物信息学分析

对斑点印迹阳性样品组分中肽段的氨基酸组成分析显示出明显趋势。值得注意的是，在C13组分中仅鉴定出2个抗消化肽段（GINANNNNR和IGRALDGKDVL）；由于样品量有限，这两个肽段未纳入氨基酸组成分析（表1、表2）。

表1 RKB体外模拟消化样品中血清结合肽的氨基酸组成特征

表2 ARKB体外模拟消化样品中血清结合肽的氨基酸组成特征

在RKB样品中，消化肽段的主要氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸，其含量均≥8%。疏水性氨基酸占总残基的48.5%～49.4%。值得注意的是，半胱氨酸和色氨酸的含量与HPLC峰时间呈负相关。此外，还观察到带负电荷与带正电荷残基的分布较为均衡。与之相反，在ARKB样品中，甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和亮氨酸共占总残基的48.7%。与RKB 样品相比，ARKB样品中疏水性氨基酸含量显著增加，范围为49.7%～54.2%，这表明其结构稳定性有所增强。蛋氨酸和半胱氨酸，在样品中含量相对较低。同时，包括天冬氨酸/天冬酰胺、谷氨酸/谷氨酰胺在内的酸性氨基酸，其含量变化极小。

在RKB和ARKB样品中，亲水/疏水残基比例均衡且赖氨酸含量较高，这可能表明肽段具有构象稳定性，从而能够与抗体发生相互作用。高压灭菌处理减少了抗胃蛋白酶水解的肽段（如G3LEA、α-AI），这可能是蛋白质变性所致；但与此同时，菜豆素中疏水基团的暴露增加，使其消化率提高，且抗原性肽段释放量增加。表3～6分别列出了菜豆素、凝集素、α-AI、G3LEA和豆球蛋白的抗消化肽序列。研究通过IBCE-EL和ILBE在线服务器，对抗消化肽作为抗原表位的潜力进行了分析；当且仅当两个服务器均预测某一肽段为抗原表位时，该肽段才可被视为菜豆蛋白的潜在致敏肽。

表3 红芸豆消化产物中菜豆蛋白相关免疫反应肽的HPLC-MS/MS分析及抗原性预测

表4 红芸豆消化产物中凝集素相关免疫反应肽的HPLC-MS/MS分析及抗原性预测

表5 红芸豆消化产物中G3LEA相关免疫反应肽的HPLC-MS/MS分析及抗原性预测

表6 红芸豆消化产物中豆球蛋白相关免疫反应肽的HPLC-MS/MS分析及抗原性预测

Conclusion

本研究系统探究了高压灭菌处理对红芸豆蛋白质致敏性及消化性的影响。结果表明，高压灭菌可显著降低G3LEA、α-AI等热不稳定型致敏原在胃中的残留量。然而，这种缓解效应被凝集素亚基及菜豆素同源蛋白增强的抗酶解性所抵消——消化后这些蛋白仍保留了超过10%的残留免疫反应性。热力处理过程中疏水性残基的暴露及蛋白质结构重排，可能破坏了蛋白质的天然构象，反而反常地增加了ARKB样品的抗原多样性。值得注意的是，高压灭菌后凝集素衍生肽段含量增加，而菜豆素片段在致敏图谱中占主导地位，这凸显了它们作为热稳定表位的作用。质谱与生物信息学分析进一步揭示，菜豆素衍生基序（如VLVKPIQIR、LPQQADAE）及凝集素表位（VGSEPKDKGG、LQRDATVSS）与其他豆类同源致敏原存在交叉反应性，且豆球蛋白亚基含有与花生球蛋白相似的IgE结合基序。这些研究结果阐明了热力加工在缓解与加剧致敏风险中的双重作用，强调需通过精准食品工程技术在保留营养与降低致敏原含量之间实现平衡。未来研究应优先采用结构疫苗学方法，开发低致敏性豆类品种，同时维持其营养完整性。

Autoclave processing modulates allergenic potential of red kidney beans (Phaseolus vulgaris L.): proteomic and bioinformatics insights after in vitro gastric digestion

Rong Zhang1†, Kailin Feng1†, Yongfei Wang1†, Shudong He1*, Sophia Xue1, Xinping Qian1, John Shi2*

1 School of Food and Biological Engineering, Engineering Research Center of Bio-Process of Ministry of Education, Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province, Hefei University of Technology, Hefei, 230009, China

2 Guelph Research and Development Center, Agriculture and Agri-Food Canada, Guelph, ON, N1G 5C9, Canada

† Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Red kidney beans (Phaseolus vulgaris L.), a nutrient-dense legume, face significant limitations in food applications due to persistent allergenicity. The dual effects of industrial autoclaving (121 °C, 15 min) on allergenicity modulation were evaluated through in vitro gastrointestinal digestion models in this study, integrated with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS), immunoblotting, and computational epitope prediction. Electrophoretic profiling demonstrated partial degradation of major allergens for 43 kDa phaseollin-like protein, lectin subunits (31/25 kDa). Legumin α-subunits exhibited pepsin resistance (74.8% stability), contrasting with rapid degradation of α-amylase inhibitor (α-AI) and group 3 late embryogenesis abundance (G3LEA) proteins. Chromatographic immunoreactivity screening revealed autoclaved samples generated 8 antigenic fractions, including novel hydrophobic peptides with enhanced immunoglobulin E (IgE)-binding potential. Mass spectrometry identified 849 and 1 516 unique peptides in raw and autoclaved digests, respectively, with phaseollin and lectins dominating post-processing epitopes. Bioinformatics highlighted conserved allergenic motifs (e.g., VLVKPIQIR, LPQQADAE) in phaseollin and lectins, alongside cross-reactive sequences homologous. Paradoxically, autoclaving reduced intact allergen content but amplified immunoreactive diversity through conformational exposure of epitopes and hydrophobic residue enrichment. These findings underscore the necessity for epitope-specific risk assessment in legume processing, balancing benefits of thermal intervention against unintended allergenic consequences.

Reference:

Zhang, R., Feng, K., Wang, Y. et al. Autoclave processing modulates allergenic potential of red kidney beans (Phaseolus vulgaris L.): proteomic and bioinformatics insights after in vitro gastric digestion. Agric. Prod. Process. Sto. 1, 18 (2025). https://doi.org/10.1007/s44462-025-00018-4

翻译：王立磊（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片来源：图虫创意

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