《食品科学》：合肥师范学院朱桂兰教授等：不同接枝顺序三元共价复合物对蓝莓花青素的稳态作用

蓝莓花青素（ACNs）是一种天然水溶性植物色素，属于类黄酮多酚类化合物，具备延缓神经衰老、预防心血管疾病、调节肠道菌群、增强视力、抑制微生物生长等作用，是一种极具开发潜力和研究价值的食品功能因子。但ACNs在加工和储存过程中稳定性较差，对光、热、pH值等条件都较为严苛，急切需要一种方法提高ACNs在食品加工、储运及销售过程中的稳定性。目前用于提高花色苷稳定性的递送系统主要有蛋白质递送系统、多糖递送系统以及复合递送系统。众多研究表明由复合物组成的递送系统，与单一组分形成的相比，抗不利环境因素能力增强，具有更高的负载率，可以较好地实现复合物对功能因子的缓释等作用。

乳清蛋白（WPІ）具有的优良的结构和功能特性（如乳化活性、起泡性能、凝胶特性等），是构建食品功能因子递送体系的良好材料。结冷胶（GG）是一种微生物阴离子胞外多糖，由于其分子结构中含丰富的羧基和酰基，与食品中的功能因子具有很强的亲和力，易形成稳定复合物，因此常常用作递送系统的包埋材料。茶多酚（TP）作为一种酚类化合物，其在生物体中能够显示出强大的抗氧化性能和生物活性，将TP接枝于不同的生物活性大分子当中，可以赋予其他生物大分子良好的性能特质。

安徽大学生命科学学院周欣，合肥师范学院生物与食品工程学院黄金路、朱桂兰*等以WPІ、GG、TP为原料，制备不同接枝顺序的功能因子传递体系，负载ACNs。并进一步分析不同接枝顺序复合物结构和功能特性的差异以及其在ACNs递送体系中的应用，以期为新型多功能食品配料的开发和高性能食品传递体系的构建提供理论支持。

01

三元复合物的制备与表征

以WPІ、GG和TP为原料，采用美拉德接枝法和碱处理法制备不同接枝顺序共价复合物（WPІ-GG-TP和WPІTP-GG）。用紫外光谱、荧光光谱和红外光谱对三元复合物进行表征。从图1可以看出，WPІ、GG、TP的最大吸收波长分别为280、265 nm和278 nm，相较于WPІ，WPІ-GG和WPІ-TP的最大吸收波长分别蓝移至277 nm和276 nm，表明WPІ分别与GG、TP发生了共价结合，导致WPІ的空间构象改变，且TP对WPІ结构影响更大。曹佳兴等研究发现，小麦醇溶蛋白与表没食子儿茶素没食子酸酯共价结合后，小麦醇溶蛋白的紫外吸收峰发生明显蓝移。WPІ-GG-TP和WPІ-TP-GG的最大吸收波长分别移动至279 nm和280 nm，说明成功形成了三元共价复合物。

从图2可以看出，当激发波长为280 nm时，WPІ在333 nm（

由图3可以看出，WPІ在3 273（酰胺A带，代表N—H伸缩和氢键）、1 628 cm-1 （酰胺І带）和1 533 cm-1 （酰胺ІІ带）。1 450 cm-1 附近的特征峰归属于酰氨基-ІІІ或C—NH2 伸缩振动。在GG红外光谱曲线中，3 500～3 200 cm-1 处存在较宽的O—H吸收峰，1 606 cm-1 和1 408 cm-1 处的特征条带是由COO—不对称及对称伸缩振动引起的；在2 932 cm-1 和1 028 cm-1cm-1 处观察到CH2 和羟基C—O的伸缩振动。TP在3 258 cm-1 处有一处特征峰，来自酚羟基的振动收缩。

酰胺І和ІІ带是蛋白质的特征条带，只受蛋白质二级结构的影响，可以用来判定蛋白质的结构变化。在WPІ-GG和WPІ-TP吸收光谱中，酰胺І和ІІ带的形状和位置均发生变化，表明蛋白质二级构象发生变化。WPІ-GG光谱中N—H伸缩和氢键吸收峰从3 273 cm-1 移动至3 279 cm-1 ，酰胺ІІ带从1 533 cm-1 移动至1 531 cm-1 并明显增强，在1 028 cm-1 处，WPІ-GG的吸收强度明显高于天然GG，这表明在WPІ-GG中产生了新形成的C—N共价键。WPІ-TP光谱中酰胺A带从3 273 cm-1 偏移至3 283 cm-1 ，酰胺І带从1 628 cm-1 ，移动至1 635 cm-1，酰胺ІІ带从1 533 cm-1 移动至1 536 cm-1，表明TP与WPІ的共价结合导致WPІ的二级结构发生变化，可能与蛋白质中的—NH2 与TP的酚环之间的共价相互作用有关。

与WPІ相比，三元共价复合物的酰胺A带吸收峰强度增加，说明共价结合导致羟基数量增加。WPІGG-TP与WPІ-TP-GG的酰胺І、ІІ带分别于1 607 cm-1 与1 605 cm-1 处合并成新峰，对比不同接枝顺序发现共价TP对WPІ 的三级结构影响更大，该结果与荧光结果一致。

02

ACNs纳米颗粒的性能分析

2.1 粒径与电位、负载率

由表1可知，WPІ-GG-TP的平均粒径与WPІ-TPGG的粒径相近，说明接枝顺序对总体结构影响不大。WPІ-GG-TP电位绝对值高于WPІ-TP-GG，可能的原因是WPІ-GG-TP的共价接枝提高了蛋白质的空间斥力，说明先接枝GG形成的溶液更加稳定。先接枝TP复合物的电位的绝对值低于先接枝GG，这是由于TP中和了WPІ的部分正电荷基团，使更多的羟基引入蛋白质分子中，增加了蛋白质的负电荷。不同接枝顺序的2 个三元共价复合物负载ACNs后粒径大小存在显著差异（

P

2.2 差示扫描量热分析

如图4所示，WPІ、GG、TP、ACNs的热吸收峰温度分别为50.24、48.43、48.41、54.40 ℃。与WPІ相比，三元复合物的热峰温度提高3.5～4.4 ℃，说明三元共价复合物的形成导致蛋白质的热变性温度升高，这有助于提高产品中WPІ的热稳定性。这与GG的空间位阻对蛋白质肽链伸展的影响有关。WPІ-TP-GG-ACNs的热峰温度相较于ACNs提高了2.51 ℃，说明先接枝TP的三元共价复合物能够更好地提高ACNs的热稳定性。

2.3 抗氧化性

如图5所示，ACNs的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和铁还原力分别为52.78%、16.06%、0.550，WPІGG-TP-ACNs和WPІ-TP-GG-ACNs的DPPH自由基清除率分别为82.40%和75.76%，与ACNs相比提高了29.62%和22.98%；羟自由基清除率分别为55.50%和72.02%，与ACNs相比提高了39.44%和55.96%；铁还原力分别为1.230和1.321，与ACNs相比提高了1.24 倍和1.4 倍。3 种方法测定ACNs纳米颗粒的抗氧化性均显著高于单独的ACNs，说明ACNs纳米颗粒具有优良的抗氧化活性，这是因为ACNs以游离态存在时，极易受到外界光照、温度等的影响而发生降解，导致抗氧化性降低，而将其包埋于纳米复合物中，可减少ACNs与外界因素的接触，避免产生分解等不良反应，而保护了ACNs的抗氧化能力。其次，多酚的结构中具有酚羟基，也具抗氧化作用。WPІ-TP-GG-ACNs和WPІ-GG-TP-ACNs的DPPH自由基清除率和铁还原力无显著性差异，而WPІ-TP-GG-ACNs的羟自由基清除率显著高于WPІ-GG-TP-ACNs，可能是由于共价TP可以增加复合物的质子给予体和电子供体，从而显著提高复合物的抗氧化活性，但是先接枝GG导致多糖的空间位阻作用阻碍了多酚与蛋白质的接枝，并且使得WPІ-GG-TP-ACNs复合物体系的羟自由基清除率较WPІ-TP-GG-ACNs低。

2.4 pH值稳定性

从图6可以看出，当pH值为3或11时，ACNs的粒径明显大于pH 7时，而ACNs纳米颗粒在不同pH值条件下变化幅度较小，性质相对稳定，可能是多糖的共价交联形成的空间位阻作用所致。从PDІ值也可以看出，pH值为3或11时，ACNs纳米颗粒的PDІ值均小于ACNs，说明ACNs纳米颗粒的分布较为均匀。从Zeta电位可以看出，当pH值为11时，ACNs纳米颗粒的Zeta电位突然增加，可能的原因是蛋白质和多糖上的羧基解离，释放出更多的负电荷，负电荷累积在颗粒表面，导致Zeta电位增加。与游离ACNs相比，ACNs纳米颗粒在pH值为11时粒径较低，Zeta电位绝对值更高，具有更好的稳定性。

2.5 热稳定性

如图7所示，80 ℃加热20、40、60、90、120 min和150 min后，ACNs的保留率分别为13.3%、12.8%、12.3%、11.9%、10.2%和9.3%。加热20 min以内ACNs的保留率变化极大，这是ACNs没有受到保护作用而发生了降解，当ACNs被负载在三元复合物中时，加热后ACNs的保留率明显得到较大提升，如在20 min时，WPІGG-TP-ACNs和WPІ-TP-GG-ACNs的保留率分别提高了50.5%和59.9%，说明三元复合物能明显提高ACNs的热稳定性。ACNs纳米颗粒的热稳定性大小为：WPІ-TP-GGACNs＞WPІ-GG-TP-ACNs，可能的原因是GG在共价连接中起到一定的空间排斥作用，阻碍了ACNs的聚集，而先接枝TP由于酚羟基等活性基团与其他基团较强的相互作用，阻止了蛋白质的展开，为后接枝GG提供了更稳固的基础。这一结果与ACNs纳米颗粒差示扫描量热分析结果一致。

2.6 储存稳定性

如图8所示，4 ℃避光储存1、5、10、30 d后，ACNs的保留率分别为12.2%、11.1%、11.1%、10.4%。当ACNs被负载在三元复合物中时，保留率均有明显提高，如在第10天时，WPІ-GG-TP-ACNs和WPІ-TP-GG-ACNs的保留率分别提高了48.9%和46.1%，这是因为WPІ所形成的蛋白质保护膜与GG形成的网络结构，共同为ACNs提供了保护屏障，使其不易受外界环境的干扰，三元复合物具有良好的抗氧化性能，从而减少ACNs的降解和损失。ACNs纳米颗粒的储存稳定性大小为：WPІ-GG-TP-ACNs＞WPІ-TP-GG-ACNs，可能与WPІ先与GG的凝胶网络结合，易形成更加紧密且稳定的复合物结构，共同起到对ACNs的保护作用。

03

结论

本实验基于美拉德接枝法和碱处理法以不同接枝顺序制备三元共价复合物（WPІ-GG-TP和WPІ-TP-GG），一系列结构表征表明复合物WPІ-GG-TP和WPІ-TP-GG之间产生了共价结合。使用三元共价复合物负载ACNs，先接枝GG的WPІ-GG-TP-ACNs负载率为21.80%，而先接枝TP的WPІ-TP-GG-ACNs负载率为18.68%。抗氧化和稳定性实验结果表明，与游离ACNs相比，先接枝GG的三元复合物负载ACNs后，DPPH自由基清除率提高了29.62%，热稳定性提高了50.5%，储存稳定性提高了48.9%。而先接枝TP的三元复合物负载ACNs后，羟自由基清除率提高了55.96%，铁还原力提高了1.4 倍，热稳定性提高了59.9%，储存稳定性提高了46.1%。

综上所示，在制备三元共价复合物递送ACNs时，若追求更高的抗氧化性及热稳定性推荐优先接枝多酚，而追求更高的储存稳定性推荐优先接枝多糖。本研究结果为研究食品级共价复合物对生物活性物质性能的提升提供更多的递送载体种类选择，同时为递送载体的接枝顺序影响提供参考。

本文《不同接枝顺序三元共价复合物对蓝莓花青素的稳态作用》来源于《食品科学》2025年46卷第6期73-79页，作者：周 欣，黄金路，陈梦琳，冯论益，朱桂兰*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241016-095。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：梁雯菁；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网