元码环化系统| 根据序列内源性的多茎环结构，设计环状RNA前体

本期内容我们聚焦Hi-Scarless-PIE 环化策略—依据待环化序列内部的多茎环结构（TLSL 元件），设计环状 RNA 前体。

设计 Hi-Scarless-PIE 环化系统线性前体

待环化序列为 CVB3 IRES+Gluc，采用 Hi-Scarless-PIE 环化策略，应该如何设计环化 RNA 线性前体序列呢？

第一，获取 TLSL 环化模块。打开 RNA 二级结构预测网站 RNAFold，查看 CVB3-IRES 序列二级结构，发现 TLSL 环化元件（类似 tRNA 三叶草二级结构）位于 CVB3 IRES 的第 1 至第 94 位的核苷酸序列，命名为 TLSL‑CVB3‑IRES 序列。

第二，确定核酶剪接位点。将剪接位点设计在 TLSL‑CVB3‑IRES 二级结构中的靠近 5'端的第一个茎环的 loop 上，即位于 TLSL‑CVB3‑IRES 序列的第 22 位 U 和第 23 位 C 之间。

第三，构建待环化 RNA 的线性对应体序列。假定 CVB3 IRES 和 GLuc CDS 编码区首尾连接形成目标环状 RNA，在上一步骤确定的核酶剪接位点处断开该环状 RNA，从而形成目标或者 RNA 的线性对应体。

第四，以经典 Ana-PIE 环化前体序列为基础，将 Ana‑PIE 核酶的 3'端切片、目标环状 RNA 序列的线性对应体、Ana‑PIE 核酶突变改造后的 5'端切片依次相连。注意，为形成稳定的核酶 P1 结构，需将 Ana‑PIE 核酶 5'端切片的第 10 位 A 突变为 T,第 11 位 G 突变为 C，以使其与待环 CVB3-IRES(1-22nt)3’末端的 G 和 A 配对。

前体设计好以后，元码采用的环化反应条件为：将 IVT 反应合成的 circRNA 前体分子加入到终浓度为 2mM GTP 的环化反应缓冲体系中（50mM Tris‑HCl，10mM MgCl2，1mM DTT，pH 7.5），在 55℃条件下，反应 15min。凝胶电泳结果显示，以 IRES 序列中的 TLSL 结构元件为基础设计的 Ana-PIE 前体，需要依据待环化序列 3'末端剪接，对 Ana‑PIE 核酶 5'端切片突变改造，形成稳定的 P1 结构才能高效成环。如果使用天然的 Ana‑PIE 核酶 5'端切片，线性前体将无法成环。

剪接位点的选择对环化反应效率的影响

以 IRES-CVB3-TLSL 元件为基础，设计 circCVB3-Gluc 对应的环化反应线性前体序列时，研究人员想了解在 TLSL 元件中，不同位置的剪接位点会对环化反应造成何种影响？结果发现，如果将剪接位点设计在 TLSL 环化元件的茎区上或端 loop 上但所选的端 loop 较小时，可以实现环化，但环化效率明显降低。因此，TLSL 环化元件上的核酶剪接位点最优设计应该是位于茎环的端 loop 上，且端 loop 的大小应该≥4nt。

Ana‑PIE 核酶 5'端切片剪接突变对环化效率的影响

以 IRES-CVB3-TLSL 元件为基础，设计 circCVB3-Gluc 对应的环化反应线性前体序列时，研究人员想了解 Ana‑PIE 核酶 5'端切片 P1 与 IGS 结构中的碱基突变改造会对环化效率产生何种影响？结果发现，如果将 Ana‑PIE 核酶 5'端切片的第 10‑17 位和第 10‑19 位进行突变，可能影响了核酶的某些核心模块，从而导致核酶催化活性受到影响，无法形成环化 RNA。研究人员认为，对Ana‑PIE 核酶 5'端切片的第 10‑16 位之间的区域的部分或全部核苷酸进行突变改造，使得该区域与目标基因形成部分或全部互补配对，将能保障改造后的核酶的自剪接环化效率处于较高水平。

不同核酶-TLSL 组合的环化效率

除了 CVB3-IRES 序列中的 TLSL 元件，其他含有 TLSL 元件的 IRES 序列，是否也可以通过 Hi-Scarless-PIE 环化策略来高效制备环状 RNA 呢?研究人员选择了一系列含有 TLSL 元件的 IRES 序列，相应地突变 Ana‑PIE 核酶 5'端切片碱基，构建 circIRES-Gluc 环化反应前体。结果显示，不同 IRES 序列中的 TLSL 元件均能发现高效环化，说明 Hi-Scarless-PIE 环化系统具有通用性。

插入预设的 TLSL 元件高效环化

并非所有的 RNA 分子中均含有 TLSL 结构元件。研究人员发现，在没有 TLSL 元件的 IRES 序列（EMCV/CrPV）中插入预设的 TLSL 元件(CVB3-IRES-TLSL)，待环化目的 RNA 序列（GLuc）也可通过 Hi-Scarless-PIE 系统高效率环化，而且，在 IRES 序列中插入预设的 TLSL 元件的环状 RNA 蛋白表达水平也获得提升。这说明，任意的 IRES 序列（天然存在 TLSL 或者插入 TLSL）均可通过 Hi-Scarless-PIE 系统高效环化。

Hi-Scarless-PIE 环化系统制备的环状 RNA 具有更低的免疫原性

研究人员发现，在 A549 细胞中，相比经典 PIE 系统制备的环状 RNA，Hi-Scarless-PIE 环化系统制备的环状 RNA 能够诱导更低的天然免疫反应相关的细胞因子，呈现更低的免疫原性。

Hi-Scarless-PIE 环化系统制备的环状 RNA 蛋白表达

通过 Hi-Scarless-PIE 环化系统制备携带不同 IRES 的环状 RNA，转染细胞，检测蛋白表达水平。结果发现，同一细胞中，不同 IRES 序列蛋白表达水平不同；在不同的细胞中，同一种 IRES 序列蛋白表达水平也不同。也就是说IRES 介导的环状 RNA 蛋白表达呈现细胞和组织选择性。IRES 序列既介导高效环化，又负责蛋白表达的组织特异性选择，因此，理论上，对于任意蛋白的 CDS 序列来说， Hi-Scarless-PIE 环化系统都可实现高效环化和组织选择性表达。

在细胞水平（HEK293T/A549），与线性 mRNA 相比，Hi-Scarless-PIE 环化系统或者经典 PIE 制备的环状 RNA 蛋白表达水平更高，持续时间更久。在小鼠体内，静脉注射或者肌肉注射，Hi-Scarless-PIE 环化系统均可正常表达目的蛋白，其表达水平略优于经典 PIE 制备的环状 RNA。

小结

元码 Hi-Scarless-PIE 环化系统最为特别的地方在于：模仿天然 Ana-tRNA-leu 三叶草样二级结构，将 Ana 核酶剪接位点置于 IRES 序列的 TLSL 结构元件中，无需额外的 PolyAC Spacer 和 Internal Homology，只需选择突变 Ana‑PIE 核酶 5'端切片 IGS 序列内的碱基，便可高效成环。绝大多少 IRES 序列中存在 TLSL 元件，即便不存在，也可选择插入预设的 TLSL 元件，所以，对于任意一条 CDS-mRNA 序列来说，均可采用 Hi-Scarless-PIE 环化系统完成环化。

参考文献

1. 一种通用的制备环状RNA的方法及其用途，申请公布号119662636 A.

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