in vivo CAR 免疫疗法

简介

嵌合抗原受体（CAR）工程化免疫细胞疗法代表了癌症治疗领域的一项重大进展。然而，复杂的体外细胞制备流程和严格的患者筛选标准限制了其广泛应用。

体内CAR工程正成为一种前景广阔的“即用型”治疗策略，具备简化生产、免除患者个体化制备、降低成本并简化供应链等多重优势。大量临床前研究激发了针对实体瘤等难治疾病的深入探索，并推动了旨在提升体内CAR工程疗效、细胞治疗持久性及安全性的新一代产品开发。

一、3种方式对比（自体体外、通用体外和体内）

（1）所有已上市的 CAR-T 产品均基于自体 T 细胞的体外工程：先从患者体内分离 T 细胞，再用慢病毒或逆转录病毒将 CAR 基因导入其中；随后给予淋巴细胞清除预处理，使工程细胞获得稳态优势（减少与内源免疫细胞的竞争，并清除可能抑制 CAR-T 功能的调节性 T 细胞，从而增强其存活、扩增及抗肿瘤效力）；最后将改造后的细胞回输同一患者（图 1a）。这种“一人一药”的个性化制造模式复杂且昂贵，难以像常规药品那样批量生产，成为推广应用的主要障碍。

图 1 | 体外自体和同种异体 CAR-T 细胞疗法与体内 CAR-T 细胞疗法概览

（2）为克服自体 CAR-T 的生产难题，多种策略已被提出。其中最具前景的是“即用型”同种异体 CAR 工程细胞产品：从健康供者获取细胞，经工程改造后制成可冻存的通用库存（图 1b）。其优点包括产品可立即使用、制造工艺标准化、细胞改造时间充裕，并通过工业化流程降低成本。然而，同种异体CAR-T存在致命的移植物抗宿主病（GvHD）风险。虽然已有缓解策略在开发，但仍需淋巴细胞清除以防止宿主排斥，而清淋常伴随长期血细胞减少、中性粒细胞缺乏及反复感染。因此，亟需全新策略，在保持高效杀瘤活性的同时降低制造复杂度和成本。

（3）直接在患者体内生成CAR-T细胞（即“体内CAR工程”）被视为解决上述难题的潜在突破口（表 1，图 1c）。这种即用型产品可在受者体内即时产生CAR免疫细胞，省去个体化制造，简化物流，显著降低成本并缩短治疗等待时间。此外，采用非整合载体的体内方法或可避免体外永久基因修饰所带来的T细胞耗竭与安全隐患。

二、体内CAR不同方式对比

（1）LNP包裹的核酸

装载mRNA的LNP（LNP–mRNA）技术依托一套成熟的大规模临床生产体系，这一点已由冠状病毒病（COVID-19）疫苗的成功量产所证明。FDA的批准也进一步确认了其安全性，并凸显了其在更广泛治疗场景中的潜力，例如体内CAR工程。

给药后，LNP–mRNA 会被多种细胞摄取，特别是静脉注射时主要由肝细胞内吞。进入细胞后，mRNA从晚期内体逃逸至胞质，短暂翻译后随即降解。在LNP表面偶联抗体可使其被特定细胞类型选择性摄取。

由于mRNA仅停留在胞质，本身不稳定，不能整合进基因组，且在细胞分裂过程中会被稀释，因此基于LNP–mRNA 的工程化方案天然是“一过性”的。这意味着，若想在体内持续维持CAR表达的治疗效果，就必须频繁、重复给药。

临床前研究表明，利用 LNP–mRNA 技术在体生成 CAR-T细胞在癌症免疫治疗中具有巨大前景（图 2a）。如此生成的 CAR-T 细胞因其“短暂存在”而有望降低潜在毒性，并允许精准剂量控制；同时无需在注射前进行淋巴细胞清除。

图 2 | T 细胞体内 CAR 工程的现有策略及作用机制

目前多数借助 LNP 在体内制备 CAR-T 细胞的研究，均在纳米颗粒中掺入可识别 CD3、CD4、CD5、CD7 或 CD8 的抗体或单链可变片段（scFv）。

抗体标记的 LNP（以及后文将讨论的聚合物纳米颗粒）具有独特的药代动力学/药效学（PK/PD）特征。静脉注射 4 小时后，非靶向纳米颗粒主要被肝脏摄取，而经CD3或CD8抗体修饰的淋巴细胞靶向纳米载体则优先富集于富含 T 细胞的组织，如脾脏、淋巴结和骨髓。然而，在LNP表面偶联靶向配体会使制造工艺复杂化，降低产率和稳定性，且产品无法长期冷冻保存。

（2）LNP 或聚合物封装核酸

阳离子可降解聚(β-氨基酯)（PBAE）聚合物制剂可通过静电作用与带负电的核酸（DNA 或 mRNA）自组装，并在内吞后依赖pH变化实现内体逃逸。研究人员进一步将这些聚合物与含有微管相关序列和核定位信号的肽段偶联，借助微管运输机制加速遗传货物入核。

PBAE聚合物纳米颗粒可生物降解，在人源化小鼠体内循环半衰期仅1–7小时；动物实验表明，即使高剂量颅内给药也未见毒性。其制备可采用纳米沉淀、乳液聚合或溶剂挥发等成熟工艺，且可通过冻干制成干粉，便于储存、提高稳定性并降低成本。临床前模型已证实，PBAE纳米颗粒可用于体内T细胞基因工程（图 2b）及体外巨噬细胞基因工程。

为实现对 T 细胞的特异性递送，研究者将聚谷氨酸与抗 CD8 或抗 CD3 抗体偶联，该复合物再通过静电作用吸附于 PBAE 颗粒表面。随后，这些靶向纳米颗粒可装载：

• 质粒 DNA（可设计为整合或非整合型）；

• 转座子DNA（可将构建体整合到安全港位点26,27）；

• 编码CAR的mRNA。

综上，PBAE聚合物纳米颗粒制备简单、稳定性高，便于储存且成本较低，为体内诱导 CAR-T 细胞免疫提供了可行、灵活且适用范围广的解决方案。然而，与LNP相比，后者在包封效率、抗降解保护及临床 mRNA疫苗应用中已建立的安全性方面更具优势，但PBAE纳米颗粒仍需就规模化生产、长期生物相容性及潜在毒性进行深入研究。

（3）慢病毒递送系统

慢病毒是一类具有球形包膜、单股RNA基因组的逆转录病毒亚型，因其能将外源基因整合到宿主基因组中，从而实现转基因的长期表达。慢病毒载体已被广泛用于向T细胞递送外源基因。然而，其在体内的感染效率常受限于病毒本身对靶细胞的低亲和力以及T细胞通常处于静息状态。为提高其体内T细胞转导效率，研究者采用了多种病毒包膜进行假型化，包括尼帕病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒以及 cocal 融合糖蛋白等。此外，慢病毒还可通过将单链抗体（scFv）或设计的锚蛋白重复蛋白（DARPins）与病毒表面的糖蛋白复合体基因融合，实现对特定 T 细胞亚群的靶向感染（图 2c）。

慢病毒已被广泛用于体外治疗应用，其临床级生产工艺及试剂已成熟，可实现 CAR 转基因的稳定整合与表达。然而，当用于体内时，病毒永久整合带来的安全性顾虑显著升高，包括可控整合、潜在非预期突变及长期风险等问题。因此，体内应用慢病毒载体需对靶细胞类型实施严格控制，且仅在经过严格安全性评估后才可能进入临床试验并最终获批。

（4）基于 AAV 的递送系统

腺相关病毒（AAV）是一种无包膜的小病毒，具有二十面体衣壳结构和单链DNA基因组，不会整合到宿主基因组中。其衣壳可被工程化改造，以展示scFv、DARPins等多种蛋白；这些衣壳修饰对于实现特定细胞靶向、减少非特异性摄取至关重要。

凭借长期转基因表达、表型纠正能力强且毒性低等优势，AAV已成为治疗性基因递送的关键载体。与慢病毒相比，AAV DNA以稳定的附加体形式存在，可抵抗外切酶降解，并利用宿主内质网完成脱壳。这种稳定性及附加体持久存在特性，使AAV成为体内基因操作的理想载体，且不带来插入突变风险。然而，AAV编码的CD4靶向CAR在记忆T细胞中长期存在，可能加剧CD4⁺ T细胞缺乏，因此在临床应用中必须配备有效的安全开关。

（5）生物指令可植入支架

将病毒载体预载入可植入多功能海藻酸支架，实现体内CAR-T细胞的工程化与释放，是“体内”与“体外”策略的混合方案。其仍需先自患者分离T细胞，但处理时间缩短至一天。不同于其他体内工程方法，海藻酸支架提供了一个局部、可控的微环境，增强 T 细胞与病毒载体、细胞因子、趋化因子之间的相互作用。通过空间局限化，可提升CAR转导效率，并减少全身工程化带来的潜在副作用（图 2d）。

（6）Cas9 包膜递送载体（Cas9-EDVs）

病毒或病毒衍生颗粒在体内基因工程中可能因非靶细胞的意外转导而产生脱靶效应，这是重大局限。

为此，研究者开发了一种技术：利用可预测的抗体–抗原相互作用，将基因组编辑机器瞬时、精准地递送至目标细胞，从而在预设基因组位点实现精确且永久的基因编辑，同时最大限度减少对旁观细胞的脱靶影响。

（7）病毒拟态融合纳米囊泡（FuNVs）

预制的CAR蛋白亦可直接插入T细胞膜内。该方法使CAR蛋白仅存在有限时间，从而降低持续CAR 介导 T细胞活化引发的细胞因子释放综合征（CRS）风险，且不存在插入突变可能。

研究者借助病毒拟态FuNVs实现工程蛋白的直接插入。FuNVs整合了T细胞融合原—抗人CD3 scFv，以及如CD19 CAR的CAR蛋白（图 2f）。

三、体内和体外工程对比

体内或体外每种途径各有优势，也面临独特挑战，涉及生产物流、疗效及安全/毒性考量（表 3）。以下从三方面系统比较。

一、物流与制造

体外自体 CAR-T：生产时间长、规模化难、成本高

体外异体 CAR-T：现货供应、可规模放大，成本低于自体产品。

体内CAR-T：“现货”+“自体”双重属性：简化放行检测、缩短供应链，降低成本与周期。
二、疗效

体外自体 CAR-T:对血液瘤成功，对实体瘤疗效有限;回输前需淋巴清除，导致免疫抑制；单靶点易逃逸；回输前体外长期激活可致耗竭。

体内 CAR-T
• 在 TME 内持续编辑与扩增，克服迁移与持久性不足。
• 可多靶点（多 mRNA 或病毒）或序贯给药，降低逃逸风险。
• 无淋巴清除，保留免疫系统完整性，促进表位扩散。
• 可与 siRNA、细胞因子 mRNA 联合，动态调节 TME。
• 初期 CAR⁺ 细胞数量少，需体内扩增，或延迟起效；肿瘤患者 T 细胞数量/功能受损时疗效受限。
• 体内分布、迁移、PK/PD 复杂；非整合载体表达短暂；整合载体需权衡插入突变风险。

三、安全与毒性

体外 CAR-T:需淋巴清除化疗，带来相应毒性;CRS/ICAN;慢病毒/逆转录病毒整合存在插入突变风险。

体内CAR-T:无需淋巴清除，避免相关毒性;非整合载体（mRNA等）无插入突变，可随时调整剂量，降低 CRS/ICAN;脱靶递送可能导致非目标细胞异常 CAR 表达，需精准靶向以避免生殖细胞转导。目前更倾向使用非整合或位点特异性整合载体。

四、展望

与现有的体外制备自体 CAR-T 细胞相比，体内 CAR 工程技术在治疗癌症等疾病时兼具经济与物流优势：可作为“即用型”产品，却仍能在患者体内生成个体化工程细胞，并省去淋巴细胞清除等预处理步骤。简化的生产流程有望为罹患多种疾病的数百万患者提供切实可行、可规模化的治疗手段。

然而，这些研究仅限于同系或人源化小鼠模型。要在人类中确立体内 CAR 工程的可行性、疗效与安全性，有待开展临床试验验证。体内 CAR 疗法的临床试验必须慎思伦理问题，尤其当 FDA 已批准的自体 CAR-T 成为标准治疗时。确保信息透明与知情同意，充分告知潜在风险、获益及不确定性，是伦理实践的核心。可能的临床应用场景包括：难治性癌症、复发/难治且选择有限的患者，以及在高度监管的专业中心开展的先导研究。适应性试验设计可在这些情境下迭代优化安全性、疗效与可行性评估，为更广泛应用奠定基础。

在各类体内 CAR 工程平台中，基于 LNP-mRNA 的 CAR 最具率先进入临床的潜力，其瞬时表达特性虽可能限制长期 CAR 存在，却有利于降低毒性并允许无基因组整合风险的再次给药。相比之下，慢病毒载体因插入突变和脱靶整合顾虑而障碍较大，除非开发出更安全的定点整合策略。

总体而言，体内 CAR 工程领域方兴未艾，有望带来医学治疗的重大飞跃。要将其确立为新治疗范式，需要科学家、临床医师与生物技术公司紧密合作，共同解决悬而未决的问题，并在疗效与安全性之间持续优化载体设计。

参考文献

Yan-Ruide Li，et al.In vivo CAR engineering for immunotherapy,nature reviews immunologyhttps://doi.org/10.1038/s41577-025-01174-1.

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