Science | 张锐团队解析锥虫寄生虫的双联微管冷冻电镜结构

锥虫寄生虫是一类寄生性原生生物，包括Leishmania、Crithidia和Trypanosoma属。它们对人类健康具有重要影响，是利什曼病、锥虫病（非洲昏睡病）和恰加斯病的致病因子。这些寄生虫依赖鞭毛在宿主体内或昆虫媒介中存活。例如，Leishmania mexicana的鞭毛型前鞭毛体（promastigote）在血食蠓（phlebotomine sand fly）体内生长，需要鞭毛运动才能从昆虫中肠迁移至口器，以便在叮咬哺乳动物宿主时完成传播。同样，Trypanosoma brucei依靠鞭毛在采采蝇（tsetse fly）内运动，且在宿主体内若缺乏运动能力则会导致寄生虫死亡。

鞭毛的摆动由轴丝（axoneme）决定。轴丝是一个由双联微管（DMTs）组成的细胞内圆柱结构，沿鞭毛延伸。冷冻电子显微镜（Cryo-EM）最近已被用于解析多种单细胞生物的DMT结构，包括Chlamydomonas reinhardtii（衣藻）【1,2】,Tetrahymena thermophila（四膜虫）【3】及各种哺乳动物纤毛细胞（详见BioArt报道：）。这些研究阐明了装饰DMT内腔及外部的蛋白及其不同的周期性。然而，大部分结构蛋白的具体功能研究尚不完整，且往往在不同生物体中独立进行，难以直接比较。

为了解析锥虫家族DMTs的结构，2025年3月14日，圣路易斯华盛顿大学张锐课题组和哈佛医学院Alan Brown课题组合作在Science上发表了文章Evolutionary adaptations of doublet microtubules in trypanosomatidparasites，研究人员使用了两种不感染人类的模型生物：双宿主的L. tarentolae（感染爬行动物）和单宿主的C. fasciculata（仅寄生于蚊科昆虫）。对于每个物种，研究人员通过机械力分离鞭毛轴丝的方法得到散开的DMTs，进而运用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）技术解析DMT的48和96 nm重复单元的结构，分辨率高达2.7埃（Å）【图1】。Alan Brown和张锐课题组分别负责Leishmania和 Crithidia的DMT的结构解析。Brown实验室的博士后Matthew Doran和张锐实验室的博士生牛清薇为本文的共同第一作者。

图1：图示摘要:锥虫双联微管的结构和功能分析

结果显示，在单个48 nm的重复单元中，研究人员发现了51种不同的MIPs，其中27种是锥虫寄生虫或更广泛的kinetoplastids特有的MIPs，此外还发现了一种由五个亚基组成的dynein-docking complex，以及一类新型的MAPs，称为ArcMAPs。

研究还发现，一些MIPs来自旁系同源基因（paralogous genes）。这些同源蛋白在单个重复单元内的存在形成了一种新的周期性排列模式，使得DMT的MIP网络比以往解析的DMT结构更为复杂。此外，这些旁系同源蛋白还允许DMT形成近端-远端（proximal-distal）非对称性，例如，锥虫寄生虫的动力蛋白对接复合物含有特定的旁系同源蛋白，这些蛋白分别定位于鞭毛的近端或远端。这种旁系同源蛋白的分布模式和形成近端-远端非对称性的能力可能适用于大多数真核生物的鞭毛和纤毛。

锥虫类DMTs的一个特征是B-微管腔内存在的重复密度结构，这些结构被称为小桥（ponticuli），源自拉丁语。T. brucei DMTs的Cryo-ET和subtomogram averaging显示在一个48 nm的重复单元内存在3个小桥【4】。这些小桥彼此相距16 nm，并且都连接到A-微管相同的原丝（A12）。与先前预期的每个小桥对应于不同的微管内蛋白（MIP）不同，研究人员发现每个小桥实际上都是同一个由DMIP4、DMIP5和DMIP22组成的三聚复合物形成。它们共同形成一个细长的、主要由α螺旋构成的复合物。连接螺旋的柔性环提供了必要的可塑性，使其能够跨越B-微管的多个结合位点。

研究人员进一步利用锥虫寄生虫的遗传可操作性（genetic tractability）以及它们的运动行为易于记录的特点，系统性地测试了每种已鉴定蛋白对寄生虫游动行为的影响。通过CRISPR基因编辑技术，研究人员在Leishmania mexicana中分别敲除了这些蛋白。随后，研究人员使用暗场视频显微镜（dark-field videomicroscopy）测量每个突变体的游动速度和方向性。

数据分析显示，A-微管与B-微管之间的内连接（inner junction）对基因突变的干扰高度敏感。大多数内连接MIP的基因缺失都会导致显著的游动速度下降。此外，研究人员通过基于结构的生物信息学分析，发现该区域包含一组在所有具有运动性鞭毛的生物中都保守存在的核心MIPs，进一步强调了内连接区域对鞭毛运动的重要性。

综上所述，本研究的结构分析以分子水平解析了锥虫寄生虫双联微管的物种特异性特征，增强了我们对轴丝微管如何被MIPs调控和模式化的理解。通过系统性地评估每种结构验证蛋白对鞭毛运动的贡献，明确了内连接结构对于鞭毛正常运动的重要性。本研究采用了一种整合式方法，结合结构解析与系统性基因敲除分析，为揭示控制鞭毛摆动的保守机制以及锥虫寄生虫特异性机制提供了新的见解。

值得一提的是，加州大学洛杉矶分校（UCLA）的周正洪教授和Kent Hill教授联合团队在Science杂志上发表了背靠背文章Trypanosome doublet microtubule structures reveal flagellum assembly and motility mechanisms，解析了布氏锥虫鞭毛双联微管（doublet microtubules, DMTs）96 nm重复单元的高分辨率冷冻电镜结构，揭示了鞭毛组装和运动的分子机制。

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adr5507；

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adr3314

参考文献：

1) M. Ma, M. Stoyanova, G. Rademacher, S. K. Dutcher, A. Brown, R. Zhang, Structure of the Decorated Ciliary Doublet Microtubule. Cell179, 909-922.e12 (2019).

2) T. Walton, M. Gui, S. Velkova, M. R. Fassad, R. A. Hirst, E. Haarman, C. O’Callaghan, M. Bottier, T. Burgoyne, H. M. Mitchison, A. Brown, Axonemal structures reveal mechanoregulatory and disease mechanisms. Nature, 1–9 (2023).

3) S. Kubo, C. S. Black, E. Joachimiak, S. K. Yang, T. Legal, K. Peri, A. A. Z. Khalifa, A. Ghanaeian, C. L. McCafferty, M. Valente-Paterno, C. D. Bellis, P. M. Huynh, Z. Fan, E. M. Marcotte, D. Wloga, K. H. Bui, Native doublet microtubules from Tetrahymena thermophila reveal the importance of outer junction proteins. Nat. Commun.14, 2168 (2023).

4) S. Imhof, J. Zhang, H. Wang, K. H. Bui, H. Nguyen, I. Atanasov, W. H. Hui, S. K. Yang, Z. H. Zhou, K. L. Hill, Cryo electron tomography with volta phase plate reveals novel structural foundations of the 96-nm axonemal repeat in the pathogen Trypanosoma brucei. elife8, 4 (2019).

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